楊 蕾 凌 玲 郁多男

氧化應(yīng)激是德國科學(xué)家Sies H在1985年首次提出的生理概念，指的是機(jī)體在受到內(nèi)外環(huán)境有害刺激時(shí)，細(xì)胞中氧化物與抗氧物的平衡被打破所引起的細(xì)胞和組織損傷[1]。ROS在一定程度上是必需的，可以幫助機(jī)體消滅細(xì)菌，清除體內(nèi)毒素，但是當(dāng)其產(chǎn)生過多時(shí)，不能被抗氧化酶及時(shí)清除，就成了危害人體健康的一大危險(xiǎn)因素。氧化應(yīng)激理論一經(jīng)提出，研究者們對(duì)抗氧化的研究便緊緊相隨。

一、研究背景

1.紅細(xì)胞的特殊結(jié)構(gòu)：成熟紅細(xì)胞(red blood cells，RBCs)形如雙凹圓盤，是血液中數(shù)量最多的一種血細(xì)胞，游走于全身組織器官并發(fā)揮氣體交換、氧化還原、腫瘤免疫等重要生理功能。在這一過程中，RBCs不斷遭到ROS攻擊，導(dǎo)致其漸進(jìn)損傷和最終衰老，主要原因是RBCs結(jié)構(gòu)的一些特殊性：①紅細(xì)胞膜脂質(zhì)富含不飽和脂肪酸，而多不飽和脂肪酸含有雙鍵，持續(xù)暴露于高氧水平極易被過氧化[2]；②紅細(xì)胞總蛋白的95%為富含F(xiàn)e2+的血紅蛋白(hemoglobin，Hb)，鐵是自由基反應(yīng)的催化劑；③正常生理情況下，線粒體可以通過多種機(jī)制來消除ROS，但成熟紅細(xì)胞無線粒體等細(xì)胞器，所以損傷后很難自我修復(fù)。

2.紅細(xì)胞氧化損傷的機(jī)制:研究表明，在多種生理病理?xiàng)l件下紅細(xì)胞都易發(fā)生氧化損傷，降低血液供氧能力，加重組織缺氧從而影響機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力和恢復(fù)過程[3]。紅細(xì)胞發(fā)生氧化損傷后ROS會(huì)攻擊紅細(xì)胞胞內(nèi)的主要成分——Hb，Hb被氧化成高鐵血紅蛋白(methehemoglobin，MetHb)而不能再與氧氣結(jié)合向組織供氧，當(dāng)體內(nèi)MetHb含量達(dá)到一定濃度時(shí)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體昏迷甚至死亡[4]。微循環(huán)是進(jìn)行氣體和物質(zhì)交換的重要場所，紅細(xì)胞必須形變才可以穿過比自己直徑小的毛細(xì)血管到達(dá)周圍組織發(fā)揮供氧功能，維持微循環(huán)的有效灌注[5]。這一過程主要依賴于膜的完整性和變形性。氧化應(yīng)激時(shí)Hb氧化會(huì)使蛋白交聯(lián)聚合或形成二硫鍵，沉積在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，影響骨架蛋白延展性。ROS還會(huì)攻擊紅細(xì)胞膜脂質(zhì)，生成脂質(zhì)過氧化物(lipid peroxide，LPO)，如氧化應(yīng)激的標(biāo)志物丙二醛，使膜蛋白和磷脂交聯(lián)，直接破壞質(zhì)膜的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)和膜骨架蛋白，紅細(xì)胞發(fā)生異形改變，導(dǎo)致細(xì)胞膜失去良好的流動(dòng)性，脆性增加，變形能力下降[6]。這也使得紅細(xì)胞聚集，血液黏度升高，血管阻力增大，細(xì)胞壽命縮短，免疫黏附功能障礙，與許多自身免疫疾病和心腦血管疾病如高血壓、冠心病等的發(fā)生、發(fā)展及不良預(yù)后密切相關(guān)[7]。這些都表明了紅細(xì)胞抗氧化應(yīng)激機(jī)制的研究與維持機(jī)體健康密不可分。

二、硫氧還蛋白過氧化物酶-2的抗氧化作用

紅細(xì)胞運(yùn)輸氧氣導(dǎo)致其不斷接觸內(nèi)源和外源性ROS而產(chǎn)生氧化應(yīng)激。為了盡量減少ROS對(duì)細(xì)胞的損傷以及由此產(chǎn)生的應(yīng)激影響，RBCs具有廣泛的非酶抗氧化系統(tǒng)(如谷胱甘肽和維生素E)和抗氧化酶系統(tǒng)[8]。抗氧化酶系統(tǒng)包括：①超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，SOD專門清除超氧陰離子自由基；②過氧化氫酶(catalase，CAT),CAT能通過催化過氧化氫的分解來發(fā)揮抗氧化作用；③谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx),GPx可以清除過氧化氫和脂質(zhì)過氧化物。

硫氧還蛋白過氧化物酶-2(peroxiredoxin-2，Prx2)是最近發(fā)現(xiàn)的抗氧化防御酶家族成員，也是紅細(xì)胞中第3豐富的蛋白質(zhì)，利用半胱氨酸殘基分解過氧化物，能有效地清除低水平的H2O2。Nagababu等[9]建立的Prx2敲除小鼠模型表現(xiàn)為輕度慢性溶血性貧血，Hb持續(xù)自氧化會(huì)伴隨產(chǎn)生超氧化物，這是一種相對(duì)不活躍的自由基，SOD迅速將之歧化為H2O2，Prx2和GPx再進(jìn)一步分解為水和氧氣，降低Hb的自氧化作用，減輕ROS誘導(dǎo)的Hb聚集(圖1)。Rocha等[8]也指出Prx2和GPx負(fù)責(zé)清除細(xì)胞內(nèi)源性/低濃度的H2O2，平均MetHb水平和血紅蛋白降解顯著增加，降低了紅細(xì)胞變形能力。MetHb可以看作紅細(xì)胞氧化應(yīng)激的間接指標(biāo)，因?yàn)樗纳咭馕吨鳰etHb的還原水平難以跟上Hb的自氧化。

圖1 氧化應(yīng)激時(shí)血紅蛋白的氧化還原

在紅細(xì)胞抗氧化酶中，Prx2是唯一一種至少部分與膜相關(guān)的酶。在正常條件下，約5%的Prx2通過C-末端綁定膜帶3蛋白與膜結(jié)合，被證明可以清除脂質(zhì)氫過氧化物，防止血紅蛋白降解產(chǎn)物的形成以及所伴隨的鐵的釋放，抑制紅細(xì)胞變形能力受損和酶活性的下降[8，10]。考慮到紅細(xì)胞中Prx2的高濃度，5%是不容忽視的。還有進(jìn)一步的研究表明，Prx2與膜的結(jié)合程度受氧化應(yīng)激和缺氧的影響，Prx2是在缺氧條件下與膜結(jié)合Hb自氧化產(chǎn)生的H2O2反應(yīng)的首選酶，可以抑制細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)損傷所導(dǎo)致的紅細(xì)胞膜形態(tài)改變[11]。

三、miR-144/451與紅系氧化應(yīng)激

紅細(xì)胞系由不同發(fā)育階段的紅細(xì)胞組成，從原始紅細(xì)胞分化脫核最終變?yōu)槌墒旒t細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，這一發(fā)育過程受到一個(gè)龐大且精密的系統(tǒng)調(diào)控。microRNA(miRNA)是一類長度為18～25核苷酸(nt)的非編碼小分子RNA，通常降低靶基因轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性或抑制靶基因轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)[12]。miR-144/451在人和小鼠基因組中分別位于17號(hào)和11號(hào)染色體上，是一個(gè)雙順反子基因位點(diǎn)，編碼兩個(gè)高度保守的miRNAs：miR-144-3p和miR-451a。miR-144/451在紅細(xì)胞內(nèi)表達(dá)很豐富，且?guī)缀跬耆嬖谟诩t細(xì)胞中[13,14]。主要有以下轉(zhuǎn)錄因子參與miR-144/451紅系氧化應(yīng)激過程。

1.FOXO3a(forkhead box O3a)：FOXO3a作為紅系中一個(gè)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在氧化應(yīng)激的多個(gè)信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控一些凋亡/細(xì)胞生長相關(guān)基因在凋亡和細(xì)胞生長中起著關(guān)鍵作用[15]。FOXO家族的成員具有一個(gè)獨(dú)特的高度保守的叉頭DNA結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域受蛋白激酶Akt、SGK和IKKβ負(fù)調(diào)控。這些激酶對(duì)FOXO3a的磷酸化作用導(dǎo)致FOXO3a從細(xì)胞核移送到細(xì)胞質(zhì)，轉(zhuǎn)錄活性被抑制。最近的研究也揭示了FOXO在保持造血干細(xì)胞自我更新能力方面的重要性，F(xiàn)OXO3a在應(yīng)對(duì)生理氧化應(yīng)激中起重要作用，從而調(diào)解在HSC隔間中靜默和增強(qiáng)存活率，這是其長期再生潛力所必需的功能[16]。小鼠miR-144/451基因被敲除后，紅細(xì)胞氧化應(yīng)激的敏感度顯著增加，這主要由于miR-451靶基因Ywhaz的表達(dá)明顯增高所致。ROS水平增高又使得AKT急劇磷酸化，磷酸化后的FOXO3a暴露結(jié)合位點(diǎn)與Ywhaz所編碼的14-3-3ζ蛋白形成復(fù)合物，從細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核外，并且14-3-3ζ蛋白封閉核定位信號(hào)，阻止FOXO3a再入核，降低FOXO3a轉(zhuǎn)錄抗氧化酶的功能，導(dǎo)致紅細(xì)胞中CAT和GPx-1生成減少，紅細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷加劇，貧血加重[17]。

2.NF-E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)：Nrf2是調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的另一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)[18]。氧化應(yīng)激發(fā)生后，原被Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(kelch-like ECH2 associated protein 1，Keap1)蛋白錨定在細(xì)胞骨架上的Nrf2，與Keap1解離進(jìn)入細(xì)胞核，并與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，啟動(dòng)下游靶基因抗氧化酶的表達(dá)，可以減輕ROS和親電體引發(fā)的細(xì)胞損傷，從而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)[18]。miR-144和Nrf2信號(hào)之間的潛在聯(lián)系已在許多細(xì)胞和組織類型中進(jìn)行了探索[19～21]。miR-144通過堿基互補(bǔ)原則結(jié)合Nrf2的3′非翻譯區(qū)(3′-untranslated region，3′UTR)，抑制Nrf2的mRNA翻譯。由此可見，miR-144和miR-451共同參與紅細(xì)胞的抗氧化作用。

四、丙酮酸鈉的抗氧化機(jī)制

丙酮酸鈉的抗氧化、抗炎及細(xì)胞器官保護(hù)作用已經(jīng)在多個(gè)模型中得到驗(yàn)證，也可以改善紅細(xì)胞功能，減輕紅細(xì)胞氧化損傷。目前認(rèn)為主要通過以下幾種途徑：(1)作為簡單的α-酮酸，能夠中和H2O2的氧化能力，與H2O2反應(yīng)生成二氧化碳和水，阻止H2O2濃度升高殺傷正常細(xì)胞，抑制ROS的生成[22]。(2)紅細(xì)胞因?yàn)榘麅?nèi)沒有線粒體，主要從血漿中攝取葡萄糖，90%～95%經(jīng)糖酵解途徑代謝。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生氧化損傷時(shí)，糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，即磷酸果糖激酶1會(huì)失活，使糖酵解途徑受阻。而丙酮酸是糖代謝途徑中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，在糖酵解途徑中，內(nèi)源性丙酮酸可經(jīng)由乳酸脫氫酶(LDH)催化轉(zhuǎn)化為乳酸供能，同時(shí)促進(jìn)NAD+(氧化型輔酶Ⅰ)向NADH(還原型輔酶Ⅰ)轉(zhuǎn)化。NADH可以抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，作為輔助因子在NADH脫氫酶作用下還原MetHb(圖1)。已有研究證明外源性丙酮酸鈉同樣可以阻止糖酵解障礙，保持NAD+/NADH的正常比例[23]。(3)丙酮酸鈉升高GSH/GSSG比率從而發(fā)揮抗氧化作用。磷酸戊糖途徑中，丙酮酸鈉促進(jìn)NADPH(還原型輔酶Ⅱ)的生成，NADPH是細(xì)胞內(nèi)很重要的還原當(dāng)量，最關(guān)鍵的一個(gè)作用是把氧化型谷胱甘肽(GSSG)重新還原成谷胱甘肽(GSH)，而GSH是細(xì)胞內(nèi)重要的自由基清除劑，可以保護(hù)膜蛋白和血紅蛋白中巰基不被破壞，維持紅細(xì)胞活性。

上述有關(guān)丙酮酸鈉抗氧化作用的研究在臨床上很有指導(dǎo)意義。例如，輸血是外科治療中挽救患者生命的重要手段之一，但紅細(xì)胞存儲(chǔ)效果的維持也是一大難點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn),在紅細(xì)胞儲(chǔ)存過程中，添加外源性丙酮酸鈉，可以使儲(chǔ)存血細(xì)胞的能量代謝水平提高而降低氧化應(yīng)激水平，從而改善紅細(xì)胞存儲(chǔ)損傷問題，減小回輸體內(nèi)后不良反應(yīng)的發(fā)生率[24]。

五、展 望

氧化應(yīng)激的概念提出以來，研究者在氧化應(yīng)激/抗氧化平衡等方面做了很多探索，外源性的熱輻射、環(huán)境污染、氧化還原類的物質(zhì)等都能使細(xì)胞產(chǎn)生ROS，人們尋求抗氧化劑來清除自由基以制止氧化應(yīng)激對(duì)身體的傷害。紅細(xì)胞的重要生理作用和特殊結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其更易受氧化應(yīng)激損傷。紅細(xì)胞的損傷影響著與人類健康息息相關(guān)的多種血液疾病，但目前針對(duì)紅細(xì)胞體系的相關(guān)研究還不是很多，所以進(jìn)一步科學(xué)全面的研究紅細(xì)胞抗氧化機(jī)制來預(yù)防血液疾病或改善健康是非常有必要的。希望未來能通過干預(yù)紅細(xì)胞氧化損傷后發(fā)生的血紅蛋白變性、膜脂質(zhì)和膜蛋白被破壞、酶活性降低、糖酵解受阻等中間環(huán)節(jié)，盡可能維持紅細(xì)胞正常生理形態(tài)和功能狀態(tài)。