郭秀珍 高斌禮* 郭文 劉慶梁 馮睿 吳燕珍

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050 2.包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院， 內(nèi)蒙古 包頭 014010 3.內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院， 內(nèi)蒙古 包頭 014010

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthristis，OA)是臨床常見的一種慢性退變性關(guān)節(jié)疾病，其主要病理特征為關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生退行性病變，而關(guān)節(jié)軟骨由軟骨細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成[1]。研究[2-3]表明IL-6、TNF-α、IL-8等炎性因子分泌量增加可促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而促進(jìn)OA進(jìn)展。因而抑制炎癥反應(yīng)可減少OA中軟骨退變，從而減緩疾病進(jìn)展。白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)可影響關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞基質(zhì)合成，從而參與OA發(fā)生及發(fā)展過程。研究[4]表明，IL-1β可作為體外研究中OA的誘導(dǎo)劑。LncRNA FGD5-AS1在牙周炎中呈低表達(dá)，過表達(dá)可抑制牙周炎的發(fā)展[5]。生物信息學(xué)分析顯示miR-103a-3p可能是FGD5-AS1的靶基因，研究[6]表明miR-103a-3p在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清中表達(dá)上調(diào)。但FGD5-AS1是否可靶向調(diào)控miR-103a-3p參與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展過程尚未可知。研究[7]表明，抑制NF-κB信號通路的激活可有效抑制機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng)。本研究采用IL-1β誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞模擬OA環(huán)境，檢測細(xì)胞中FGD5-AS1與miR-103a-3p的表達(dá)水平，探究其對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞炎癥損傷及細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制，為進(jìn)一步揭示OA發(fā)生與發(fā)展的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞(寧波明舟生物科技有限公司)；DMEM與胎牛血清(美國Gibco公司)；胰蛋白酶(上海鈺博生物科技有限公司)；IL-1β(美國Sigma-Aldrich公司)；Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)；pcDNA3.1(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司)；miR-103a-3p mimics及陰性對照(miR-NC)、si-FGD5-AS1及si-NC(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；IL-6、TNF-α、IL-8 ELISA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(上海朗智生物科技有限公司)；兔抗鼠Bax、Cyt C、Cleaved Caspase-3抗體(美國CST公司)；兔抗鼠p-NF-κB p65、p-IκBα抗體(美國Santa Cruz公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組：將軟骨細(xì)胞分為NC組(未進(jìn)行處理的軟骨細(xì)胞)、IL-1β組(濃度為10 ng/mL的IL-1β處理軟骨細(xì)胞)[8]。分別將pcDNA、pcDNA-FGD5-AS1、pcDNA-FGD5-AS1與miR-NC、pcDNA-FGD5-AS1與miR-103a-3p mimics轉(zhuǎn)染至軟骨細(xì)胞，在含有10 ng/mL 的IL-1β培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)48 h。

1.2.2ELISA檢測IL-6、TNF-α、IL-8濃度：收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，4 ℃條件下經(jīng)1 300 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，吸取上清，參照ELISA檢測試劑盒說明書檢測各組炎性因子IL-6、TNF-α、IL-8水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.3qRT-PCR檢測細(xì)胞中FGD5-AS1、miR-103a-3p的表達(dá)水平：采用Trizol法提取各組細(xì)胞中總RNA，應(yīng)用Nanodrop 2000c超微量分光光度計測定RNA濃度，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共循環(huán)40次。FGD5-AS1以GAPDH為內(nèi)參，miR-103a-3p以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算FGD5-AS1、miR-103a-3p的相對表達(dá)量。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率：收集各組對數(shù)期軟骨細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌，加入5 μL Annexin V-FITC與5 μL PI，充分混勻后，室溫避光孵育10 min，置于FACS Calibur流式細(xì)胞儀及應(yīng)用Cellauest軟件檢測各組細(xì)胞凋亡。

1.2.5雙熒光素酶報告基因檢測FGD5-AS1的靶基因：靶基因預(yù)測軟件starbase預(yù)測顯示FGD5-AS1與miR-103a-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，利用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，分別將結(jié)合位點(diǎn)與突變位點(diǎn)插入熒光素酶報告基因載體分別構(gòu)建野生型載體WT-FGD5-AS1與突變型載體MUT-FGD5-AS1，分別將WT-FGD5-AS1、MUT-FGD5-AS1與miR-NC、miR-103a-3p mimics共轉(zhuǎn)染至軟骨細(xì)胞，參照熒光素酶活性檢測試劑盒檢測各組相對熒光素酶活性。

1.2.6Western blot檢測Bax、Cyt C、Cleaved Caspase-3、p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白表達(dá)：收集各組對數(shù)生長期軟骨細(xì)胞，加入RIPA裂解液后經(jīng)1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min(4 ℃)，吸取上清液(總蛋白)。采用BCA檢測蛋白濃度，取40 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE反應(yīng)，將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉2 h，加入蛋白一抗稀釋液(1∶1 000)，4 ℃孵育24 h，TBST洗滌，加入二抗稀釋液(1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌，滴加ECL顯影，應(yīng)用Quantityone軟件檢測條帶灰度值。

圖1 FGD5-AS1過表達(dá)對IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的影響 A：流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率；B：細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白免疫印跡圖。Fig.1 Effect of FGD5-AS1 overexpression on the apoptosis of articular chondrocytes induced by IL-1β

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中LncRNA FGD5-AS1與miR-103a-3p的表達(dá)量

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組相比，IL-1β組軟骨細(xì)胞中FGD5-AS1的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，miR-103a-3p的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見表1。

表1 IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中LncRNA FGD5-AS1與miR-103a-3p的表達(dá)量

2.2 FGD5-AS1過表達(dá)對IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞炎癥損傷的影響

與NC組相比，IL-1β組炎性因子IL-6、TNF-α、IL-8水平顯著升高(P<0.05)；與IL-1β+pcDNA組相比，IL-1β+pcDNA-FGD5-AS1組炎性因子IL-6、TNF-α、IL-8水平顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 FGD5-AS1過表達(dá)對IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞炎癥損傷的影響

2.3 FGD5-AS1過表達(dá)對IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的影響

與NC組相比，IL-1β組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Bax、Cyt C、Cleaved Caspase-3蛋白相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與IL-1β+pcDNA組相比，IL-1β+pcDNA-FGD5-AS1組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Bax、Cyt C、Cleaved Caspase-3蛋白相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，見圖1、表3。

表3 FGD5-AS1過表達(dá)對IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的影響

2.4 FGD5-AS1靶向調(diào)控miR-103a-3p的表達(dá)

starBase預(yù)測顯示LncRNA FGD5-AS1 與miR-103a-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖2。雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染野生型載體WT-FGD5-AS1的細(xì)胞中，miR-103a-3p組熒光素酶活性顯著低于miR-NC組(P<0.05)；轉(zhuǎn)染突變型載體MUT-FGD5-AS1的細(xì)胞中，miR-103a-3p組熒光素酶活性相較于miR-NC組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與pcDNA組相比，pcDNA-FGD5-AS1組miR-103a-3p的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與si-NC組相比，si-FGD5-AS1組miR-103a-3p的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見表5。

圖2 FGD5-AS1的序列中含有與miR-103a-3p互補(bǔ)的核苷酸序列Fig.2 The sequence of FGD5-AS1 contains a nucleotide sequence complementary to miR-103a-3p

表4 雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)

表5 FGD5-AS1負(fù)向調(diào)控miR-103a-3p的表達(dá)

2.5 FGD5-AS1調(diào)控miR-103a-3p影響關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞炎癥損傷及細(xì)胞凋亡

與IL-1β+pcDNA-FGD5-AS1+miR-NC組相比，IL-1β+pcDNA-FGD5-AS1+miR-103a-3p組炎性因子IL-6、TNF-α、IL-8水平顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，Bax、Cyt C、Cleaved Caspase-3蛋白相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，見圖3、表6、表7。

表6 FGD5-AS1調(diào)控miR-103a-3p影響關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞炎癥損傷Table 6 FGD5-AS1 regulates miR-103a-3p to affect articular chondrocyte inflammation and

表7 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)量

圖3 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白免疫印跡圖Fig.3 Western blot of apoptosis-related proteins

2.6 FGD5-AS1靶向miR-103a-3p調(diào)控NF-κB信號通路

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與IL-1β+pcDNA組相比，IL-1β+pcDNA-FGD5-AS1組p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與IL-1β+pcDNA-FGD5-AS1+miR-NC組相比，IL-1β+pcDNA-FGD5-AS1+miR-103a-3p組p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，見圖4、表8。

圖4 NF-κB信號通路相關(guān)蛋白免疫印跡圖Fig.4 Western blot of NF-κB signaling pathway related proteins

表8 NF-κB信號通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)量

3 討論

FGD5-AS1在急性心肌梗死患者中表達(dá)下調(diào)，并可能參與急性心肌梗死發(fā)生及發(fā)展過程[9]。研究[10]表明,FGD5-AS1可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)GD5-AS1在IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，提示FGD5-AS1表達(dá)量降低可能促進(jìn)OA的發(fā)生及發(fā)展。同時還顯示IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中炎性因子IL-6、TNF-α、IL-8水平升高，與相關(guān)文獻(xiàn)報道相似[11]，提示IL-1β可明顯造成軟骨細(xì)胞炎癥損傷。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，F(xiàn)GD5-AS1過表達(dá)后炎性因子水平明顯降低，提示FGD5-AS1過表達(dá)可通過降低炎性因子水平而減輕IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞炎癥損傷。相關(guān)報道[12]指出細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷可促進(jìn)凋亡蛋白Bax表達(dá)，Bax表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)線粒體釋放Cyt C進(jìn)而激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示IL-1β處理后關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率明顯升高，Bax、Cyt C、Cleaved Caspase-3蛋白水平明顯升高，而FGD5-AS1過表達(dá)后可明顯抑制IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡，提示FGD5-AS1過表達(dá)可能通過調(diào)控線粒體途徑而抑制IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡。

miR-103a-3p表達(dá)量升高可能與骨骼疾病發(fā)生過程有關(guān)[13]。研究[14]表明miR-103a-3p可促進(jìn)血管緊張素II誘導(dǎo)的腎臟炎癥及纖維化的發(fā)生。本研究通過雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)FGD5-AS1靶向負(fù)調(diào)控miR-103a-3p的表達(dá)，進(jìn)一步研究顯示miR-103a-3p過表達(dá)后可明顯逆轉(zhuǎn)FGD5-AS1過表達(dá)對IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞炎癥損傷及細(xì)胞凋亡的作用，提示FGD5-AS1過表達(dá)可通過下調(diào)miR-103a-3p表達(dá)從而減輕IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞炎癥損傷，抑制細(xì)胞凋亡。相關(guān)報道[15]指出p65是NF-κB信號通路主要蛋白，正常生理狀態(tài)下NF-κB與IκB結(jié)合，若細(xì)胞受到刺激后IκB降解后可釋放NF-κB p65進(jìn)而促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞炎癥損傷。本研究結(jié)果顯示FGD5-AS1過表達(dá)后可明顯降低p-NF-κB p65、p-IκBα表達(dá)，而miR-103a-3p過表達(dá)后可明顯促進(jìn)p-NF-κB p65、p-IκBα表達(dá)，提示FGD5-AS1過表達(dá)可能通過靶向抑制miR-103a-3p表達(dá)而抑制NF-κB信號通路激活從而減輕IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞炎癥損傷，抑制細(xì)胞凋亡，對軟骨細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，F(xiàn)GD5-AS1過表達(dá)靶向抑制miR-103a-3p表達(dá)可抑制IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與抑制NF-κB信號通路的活化有關(guān)，可為深入探討FGD5-AS1對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡及炎癥的影響及分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)，有助于闡明OA發(fā)病機(jī)制及防治OA。