陳澤群 朱文雄 江銘 謝荏棠 張海濱

東莞市人民醫(yī)院骨三科，廣東 東莞 523000

骨質(zhì)疏松癥是以低骨量、骨組織退化以及微結(jié)構(gòu)破壞為特征的一種疾病，在全球具有較高的發(fā)病率，現(xiàn)階段治療骨質(zhì)疏松的藥物以作用于破骨細(xì)胞為主，而作用于成骨細(xì)胞促進(jìn)骨形成的藥物較少[1-2]。肥胖與骨質(zhì)疏松和糖尿病的發(fā)生有著相關(guān)性，近期研究[3]表明胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)的減少與骨質(zhì)疏松有關(guān)，艾塞那肽(exenatide)作為一種GLP-1受體激動(dòng)劑可用于治療骨質(zhì)疏松，但是關(guān)于其機(jī)制的研究不多[4]。P38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)參與成骨細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)、細(xì)胞周期的靜止，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡[5]。本文將主要分析艾塞那肽通過激活p38MAPK通路對(duì)成骨細(xì)胞促增殖和抗凋亡的作用機(jī)制，為臨床更好地治療骨質(zhì)疏松提供新的思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料：小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1 Subclone 14購自ATCC(美國)；MEM培養(yǎng)基以及胎牛血清購自Gibco(美國)；艾塞那肽購自禮來(美國)；CCK-8試劑盒和凋亡試劑盒購自Dojindo(日本)；流式細(xì)胞儀購自BD公司(美國)；棕櫚酸鈉購自Sigma(美國)；P38MAPK、Cyclin D1、Caspase-3一抗體和二抗均來自Abcam公司(美國)；PVDF膜(Bio-Rad，美國)。

1.1.2細(xì)胞分組與培養(yǎng)：MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞系在含有10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃，5%的CO2。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、艾塞那肽組、棕櫚酸鈉組、棕櫚酸鈉組+艾塞那肽組。棕櫚酸鈉組培養(yǎng)液棕櫚酸鈉終濃度為500 μmol/ L，艾塞那肽組培養(yǎng)中艾塞那肽終濃度為100 nmol/ L。共同培養(yǎng)48 h。

1.2 方法

1.2.1檢測細(xì)胞活力：CCK-8法被應(yīng)用于測定細(xì)胞活力。將細(xì)胞接種于96孔板，加入10 μL CCK-8試劑并在37 ℃，5%的CO2中培養(yǎng)4 h。使用酶標(biāo)儀(ELX 800，Bio-Teck，USA)測量每個(gè)孔在450 nm處的吸光度(OD)。

1.2.2檢測細(xì)胞凋亡：流式細(xì)胞術(shù)用于檢測細(xì)胞凋亡情況，細(xì)胞洗滌、重懸后分別按照試劑盒說明書加入試劑，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡率。

1.2.3Western blot檢測：使用Western Blot檢測細(xì)胞中P38MAPK、Cyclin D1、Caspase-3蛋白水平。在液氮的保護(hù)下裂解細(xì)胞，在12 000 r/min，4 ℃下離心15 min收集上清液，使用BCA方法確定蛋白質(zhì)濃度。使用10%的SDS-PAGE凝膠用于電泳，電泳后使用PVDF膜轉(zhuǎn)膜并在室溫下用5%無脂牛奶封閉2 h。加入一抗室溫震蕩2 h，后在4 ℃孵育過夜，加入二抗。使用GAPDH作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示。統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 19軟件(SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA)。進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)以評(píng)估實(shí)驗(yàn)組之間的差異。P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 艾塞那肽對(duì)細(xì)胞活力的影響

艾塞那肽對(duì)正常細(xì)胞活力無顯著影響(P>0.05)，棕櫚酸鈉組的細(xì)胞活力顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，艾塞那肽+棕櫚酸鈉組的細(xì)胞活力顯著高于棕櫚酸鈉組(P<0.01)，見表1。

表1 艾塞那肽對(duì)細(xì)胞活力的影響Table 1 Effects of exenatide on cell viability

2.2 艾塞那肽對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

艾塞那肽對(duì)正常細(xì)胞凋亡無顯著影響(P>0.05)，棕櫚酸鈉組的細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，艾塞那肽+棕櫚酸鈉組的細(xì)胞凋亡率顯著低于棕櫚酸鈉組(P<0.01)，見表2和圖1。

表2 艾塞那肽對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Table 2 Effects of exenatide on apoptosis

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測48 h時(shí)各組細(xì)胞凋亡Fig.1 Flow cytometry was used to detect the apoptosis of each group at 48 h

2.3 艾塞那肽對(duì)P38MAPK、Cyclin D1、Caspase-3的影響

艾塞那肽對(duì)正常細(xì)胞中P38MAPK、Cyclin D1和Caspase-3蛋白水平無明顯影響(P>0.05)，棕櫚酸鈉組的P38MAPK和Caspase-3顯著高于對(duì)照組而Cyclin D1顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，艾塞那肽+棕櫚酸鈉組的P38MAPK和Caspase-3顯著低于棕櫚酸鈉組而Cyclin D1顯著高于棕櫚酸鈉組(P<0.01)，見表3。

表3 艾塞那肽對(duì)P38MAPK、Cyclin D1、Caspase-3的影響

3 討論

糖尿病患者患有骨折和骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險(xiǎn)高，骨質(zhì)疏松癥最近被認(rèn)為是一種高脂性的疾病，研究[6]發(fā)現(xiàn)骨丟失通常伴隨著上調(diào)脂肪形成，糖尿病、肥胖和骨質(zhì)疏松具有密切的關(guān)系。GLP-1腸降血糖素激素主要由腸內(nèi)L-細(xì)胞和一些腦神經(jīng)元中的胰高血糖素原基因編碼，在集體中GLP-1會(huì)被酶二肽基肽酶-4(DPP-4)快速降解。GLP-1在血糖控制和胰島細(xì)胞增殖中起著至關(guān)重要的作用，艾塞那肽已經(jīng)是一種被廣泛使用的治療糖尿病的藥物，而近年來的研究發(fā)現(xiàn)艾塞那肽作為一種GLP-1激動(dòng)劑，也具有調(diào)節(jié)脂肪形成和骨生成的作用[7]。

為分析艾塞那肽對(duì)骨質(zhì)疏松的作用，本研究使用棕櫚酸鈉建立高脂模型，研究結(jié)果顯示棕櫚酸鈉可顯著的抑制成骨細(xì)胞的細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而艾塞那肽可顯著恢復(fù)棕櫚酸鈉組的細(xì)胞活力，抑制成骨細(xì)胞的凋亡。國內(nèi)最新研究[4]顯示艾塞那肽可以保護(hù)高脂環(huán)境下成骨細(xì)胞的生長并抑制凋亡。李軍等[8]的研究也發(fā)現(xiàn)GLP-1類似物利拉魯肽也可以保護(hù)高糖環(huán)境下的成骨細(xì)胞增殖和分化。國外也有研究[9]顯示GLP-1可抑制脂肪細(xì)胞分化并促進(jìn)成骨細(xì)胞的生長和分化。這提示艾塞那肽可能通過促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和抑制凋亡治療骨質(zhì)疏松。

為進(jìn)一步分析艾塞那肽對(duì)保護(hù)高脂環(huán)境下成骨細(xì)胞生長的機(jī)制，筆者分析了其對(duì)p38MAPK通路的影響。p38MAPK屬于MAPK亞類，可通過調(diào)節(jié)增殖、凋亡相關(guān)基因參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，在不同細(xì)胞中p38MAPK的作用可能不同[10]。研究[11]顯示高糖可通過上調(diào)p38MAPK通路的表達(dá)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的凋亡，而抑制p38MAPK的磷酸化可保護(hù)成骨細(xì)胞，促進(jìn)其增殖，抑制其凋亡。本次研究結(jié)果顯示艾塞那肽對(duì)正常細(xì)胞無明顯影響，棕櫚酸鈉組的P38MAPK和Caspase-3顯著高于對(duì)照組而Cyclin D1顯著低于對(duì)照組，艾塞那肽+棕櫚酸鈉組的P38MAPK和Caspase-3顯著低于棕櫚酸鈉組而Cyclin D1顯著高于棕櫚酸鈉組。Marie等[12]的研究顯示艾塞那肽可顯著提高小鼠的骨量。成骨細(xì)胞p38MAPK的過度磷酸化引起成骨細(xì)胞的凋亡[13]。黃超等[14]研究發(fā)現(xiàn)艾塞那肽會(huì)通過p38MAPK通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡。過往有研究[15]發(fā)現(xiàn)GLP-1類似物可通過抑制p38MAPK通路減輕炎性損傷。曾海龍等[16]的研究也顯示GLP-1可以抑制p38MAPK通路抗凋亡。這說明艾塞那肽可以通過抑制p38MAPK通路提高高脂環(huán)境下成骨細(xì)胞活力，抑制凋亡。

綜上所述，艾塞那肽可以通過p38MAPK通路，減少Caspase-3蛋白并上調(diào)Cyclin D1蛋白的表達(dá)，抑制高脂環(huán)境下成骨細(xì)胞的凋亡并提高細(xì)胞活力。

這提示艾塞那肽可能對(duì)肥胖引起的骨質(zhì)疏松具有一定的治療作用，但是關(guān)于艾塞那肽對(duì)成骨細(xì)胞的作用機(jī)制還需進(jìn)一步展開研究。