邱敏 翟書珩 付勤

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院骨科，遼寧 沈陽 110004

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMO)是由于雌激素缺乏或水平下降，成骨細(xì)胞承擔(dān)的骨形成和破骨細(xì)胞承擔(dān)的骨吸收活動(dòng)之間的平衡被打破，骨吸收超過了骨形成，從而引起骨量減少、骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化，進(jìn)而導(dǎo)致骨脆性增高、骨強(qiáng)度降低、骨折危險(xiǎn)性增加的一種全身代謝性骨骼疾病[1-2]。PMO過程涉及多種細(xì)胞因子信號(hào)通路的調(diào)控[3]。近年來發(fā)現(xiàn)經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路在骨形成過程中發(fā)揮重要作用，已成為骨質(zhì)疏松領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[4]。本研究通過觀察雌二醇對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠Wnt/β-Catenin信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)的影響，探討雌二醇防治PMO的相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制，為其在抗PMO的應(yīng)用提供新思路和新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

戊酸雌二醇片(補(bǔ)佳樂)購于拜耳醫(yī)藥保健有限公司(規(guī)格：1 mg/片，生產(chǎn)批號(hào)：20180083)，羊抗兔Wnt、β-catenin和BMP-2多克隆抗體購于美國R&D公司，β-actin多克隆抗體及兔抗鼠二抗體購于武漢博士德生物有限公司，Prime ScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本TaKaRa公司，PV-9000免疫組化試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。DPX-L型雙能X線骨密度測(cè)定儀購于美國GE公司，MTS-858型電子萬能生物力學(xué)材料試驗(yàn)機(jī)購于美國MA公司。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：清潔SPF級(jí)雌性SD大鼠80只，4月齡，體重(360±30)g，由中國醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，同等條件(溫度：20 ℃～25 ℃，濕度：60%～70%，12 h間隔正常照明，自由飲食攝水)分籠飼養(yǎng)。按隨機(jī)數(shù)字法分為對(duì)照組、假手術(shù)組，去勢(shì)組和藥物組。對(duì)照組常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.2骨質(zhì)疏松大鼠造模及藥物干預(yù)：參照文獻(xiàn)[5]采用雙側(cè)卵巢切除術(shù)方法構(gòu)建骨質(zhì)疏松大鼠動(dòng)物模型，假手術(shù)組僅切除卵巢周圍等量脂肪組織，去勢(shì)組和藥物組均行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。造模成功后第3天給予各組藥物處理(參照大鼠體表面積比值計(jì)算)，藥物組按照1 mL/100 g體質(zhì)量給予0.02 mg/mL戊酸雌二醇水溶液灌胃，對(duì)照組、假手術(shù)組和去勢(shì)組給予等量0.9% 氯化鈉灌胃)，1次/d，連續(xù)用藥8周。

1.2.3組織取材：藥物干預(yù)8周后，用2%戊巴比妥鈉行腹腔麻醉，采用快速心臟急性大失血法處死大鼠，逐層剝離雙側(cè)股骨，用0.9%氯化鈉濕紗布和錫箔紙包裹，-20 ℃保存?zhèn)溆么龣z測(cè)。另留取部分股骨10%甲醛溶液固定，10%EDTA脫鈣6周，脫水透明，制成石蠟切片，保存?zhèn)溆么龣z測(cè)。

1.2.4骨組織骨密度(BMD)測(cè)定：取出待測(cè)大鼠右股骨，室溫平衡30 min，通過LUNAR雙能X線吸收掃描儀掃測(cè)，采用掃描模式(掃描類型hHi-Res、掃描精度1%、掃描速度60 mm/s、掃描寬度5.0 cm、分辨率1.0 mm×1.0 mm)，用儀器選定全部股骨及股骨端上下區(qū)域，應(yīng)用軟件分析計(jì)算BMD值。

1.2.5骨組織生物力學(xué)測(cè)定：取出右側(cè)股骨，室溫平衡30 min，游標(biāo)卡尺測(cè)量股骨長(zhǎng)度，置于MTS-858型電子萬能生物力學(xué)材料試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行三點(diǎn)彎曲力學(xué)試驗(yàn)，參考指標(biāo)(支點(diǎn)跨距20 mm、最大量程1 000 N、加載速度2 mm/min)，計(jì)算機(jī)記錄儀記錄載荷-變形曲線，計(jì)算最大載荷、最大應(yīng)力和剛度。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)骨組織Wnt、β-catenin和BMP-2的基因表達(dá)：取骨組織20 mg，液氮下充分研磨至粉末，參照Trizol試劑盒說明書提取總RNA，計(jì)算RNA純度及濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作獲得cDNA，加入相應(yīng)PCR反應(yīng)體系(20 μL)，PCR熱循環(huán)儀擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性20 s，60 ℃退火50 s，延伸30 s，40次循環(huán)擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以正常組為參照組，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR擴(kuò)增引物序列Table 1 qRT-PCR amplification primer sequence

1.2.7HE染色觀察骨組織形態(tài)學(xué)：取出石蠟切片，脫蠟水化，流水沖洗，染色(蘇木精)10 min，流水沖洗，分化(鹽酸酒精)10 s，流水沖洗，返藍(lán)，蒸餾水洗滌3～5 s；染色(伊紅)2～3 min，流水沖洗；再次脫水、透明，封片，光鏡下觀察染色并采集圖片。

1.2.8免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)股骨骨組織Wnt、β-catenin和BMP-2的蛋白表達(dá)：嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，PBS緩沖液作陰性對(duì)照，一抗稀釋倍數(shù)(1∶200)，光學(xué)顯微鏡觀察并采集圖片，Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析，結(jié)果用平均光密度值(MOD)表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

圖1 各組大鼠股骨骨組織Wnt蛋白表達(dá)(×200)A：對(duì)照組；B：假手術(shù)組；C：去勢(shì)組；D：藥物組。Fig.1 The Wnt protein expression in femoral bone tissues of rats in each group (×200)

2.1 股骨骨組織BMD比較

對(duì)照組、假手術(shù)組股骨和上下端的BMD無顯著差異(P>0.05)，去勢(shì)組股骨和上下端的BMD較對(duì)照組、假手術(shù)組均顯著降低(P<0.05)，藥物組股骨和上下端的BMD較去勢(shì)組均顯著升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠股骨骨組織BMD比較

2.2 股骨骨組織生物力學(xué)比較

對(duì)照組和假手術(shù)組股骨最大載荷、最大應(yīng)力和剛度無顯著差異(P>0.05)，去勢(shì)組股骨最大載荷、最大應(yīng)力和剛度較對(duì)照組和假手術(shù)組均顯著降低(P<0.05)，藥物組股骨最大載荷、最大應(yīng)力和剛度較去勢(shì)組均顯著升高(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠股骨骨組織生物力學(xué)指標(biāo)比較

2.3 股骨骨組織Wnt、β-catenin和BMP-2的mRNA表達(dá)比較

對(duì)照組和假手術(shù)組骨組織Wnt、β-catenin和BMP-2的mRNA無顯著差異(P<0.05)，去勢(shì)組骨組織Wnt、β-catenin和BMP-2的mRNA較對(duì)照組和假手術(shù)組顯著降低(P<0.05)，藥物組骨組織Wnt、β-catenin和BMP-2的mRNA較去勢(shì)組顯著增高(P<0.05),見表4。

表4 各組大鼠Wnt、β-catenin和BMP-2的mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.4 股骨骨組織Wnt、β-catenin和BMP-2的蛋白表達(dá)比較

Wnt和β-catenin主要表達(dá)主要定位于成骨細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)，BMP-2主要表達(dá)定位于成骨細(xì)胞胞質(zhì)，陽性反應(yīng)胞質(zhì)或胞膜呈黃色或棕黃色。對(duì)照組與假手術(shù)組股骨骨組織Wnt、β-catenin和BMP-2的蛋白表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)，去勢(shì)組股骨骨組織Wnt、β-catenin和BMP-2的蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組和假手術(shù)組顯著降低(P<0.05)，藥物組股骨骨組織Wnt、β-catenin和BMP-2的蛋白表達(dá)水平較去勢(shì)組顯著升高(P<0.05)。見圖1～圖3、表5。

圖2 各組大鼠股骨骨組織β-catenin蛋白表達(dá)(×200)A：對(duì)照組；B：假手術(shù)組；C：去勢(shì)組；D：藥物組。Fig.2 The β-catenin protein expression of rat femoral bone tissues in each group (×200)

圖3 各組大鼠股骨骨組織BMP-2蛋白表達(dá)(×200)A：對(duì)照組；B：假手術(shù)組；C：去勢(shì)組；D：藥物組。Fig.3 The BMP-2 protein expression of rat femoral bone tissues in each group (×200)

表5 各組大鼠股骨骨組織Wnt、β-catenin和BMP-2的蛋白表達(dá)比較

2.5 股骨骨組織形態(tài)學(xué)比較

對(duì)照組和假手術(shù)組骨松質(zhì)結(jié)構(gòu)完整，骨小梁粗壯飽滿、均勻致密，排列規(guī)則，連接成網(wǎng)狀，骨髓腔較小，骨髓細(xì)胞數(shù)量豐富。去勢(shì)組呈骨質(zhì)疏松特征性骨松質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，骨小梁明顯減少，排列稀疏不規(guī)則，連接不完整，部分纖細(xì)或出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，骨髓腔變大，有大量纖維組織。藥物組骨松質(zhì)骨小梁數(shù)量減少不明顯，粗細(xì)均勻稍致密，排列尚規(guī)則，連續(xù)完整性較好。見圖4。

圖4 HE染色觀察骨股骨股組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)(×200)A：對(duì)照組；B：假手術(shù)組；C：去勢(shì)組；D：藥物組。Fig.4 Observation of morphological structure of femoral tissue by HE staining (×200)

3 討論

隨著全球人口老齡化程度的不斷加劇，PMO發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，目前已成為全世界關(guān)注的健康問題之一。PMO多見于絕經(jīng)后老年婦女，其并發(fā)癥常見且預(yù)后不良，給家庭和社會(huì)帶來了帶來沉重的負(fù)擔(dān)，我國已將其列為重點(diǎn)攻關(guān)的老年病之一[6]。對(duì)于PMO的防治研究目前已成為研究的熱點(diǎn)問題。

雌激素水平降低是PMO的主要原因，雌激素缺乏可導(dǎo)致成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的比例失衡，骨形成基本正常，骨吸收增強(qiáng)，骨轉(zhuǎn)換加快，骨量丟失，引發(fā)PMO發(fā)生[7]。雌激素是目前臨床應(yīng)用防治PMO的首選藥物，雌激素既可通過直接結(jié)合破骨細(xì)胞表面受體，抑制破骨細(xì)胞，延緩骨吸收，又可直接結(jié)合成骨細(xì)胞表面受體，調(diào)節(jié)成骨代謝等[8-9]。近年來，隨著對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路研究的深入，大量研究[10]表明雌激素可通過調(diào)控經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路，促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收。雌激素調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路治療PMO逐漸成為此領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路在骨形成和骨重建過程中起著關(guān)鍵性作用。細(xì)胞外Wnt因子與跨膜受體卷曲蛋白(Frz)和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(LRP5/6)相結(jié)合，通過胞質(zhì)內(nèi)的蓬亂蛋白(Dv)和酪蛋白激酶-1α(CK1α)傳遞信號(hào)，活化由軸蛋白/結(jié)腸腺瘤性蛋白/糖原合成酶激酶3β(Axin/APC/GSK-3β)復(fù)合物，使β-catenin胞質(zhì)內(nèi)大量聚集并進(jìn)入胞核內(nèi)與T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子/淋巴增強(qiáng)因子(LEF/TCF)結(jié)合形成復(fù)合聚體，激活下游基因Runx2、BMP-2、c-myc等靶基因的轉(zhuǎn)錄[11-12]。研究[13]表明雌激素可通過激活該信號(hào)通路途徑影響B(tài)MP-2活性或表達(dá)，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖和分化，增強(qiáng)成骨細(xì)胞礦化活性，抑制成骨細(xì)胞凋亡；同時(shí)調(diào)節(jié)和促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)分化為成骨細(xì)胞，增加骨強(qiáng)度，促進(jìn)新骨形成[14]。因此Wnt信號(hào)通路被認(rèn)為在成骨細(xì)胞的分化、增殖、遷移等調(diào)控方面發(fā)揮了重要作用。

本研究表明，雌二醇能顯著提高去勢(shì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨BMD、最大載荷、最大應(yīng)力和剛度，促進(jìn)骨組織Wnt、β-catenin、BMP-2的表達(dá)，改善PMO骨松質(zhì)結(jié)構(gòu)。表明Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)成骨細(xì)胞增殖分化起著關(guān)鍵性作用，PMO大鼠骨組織Wnt/β-catenin信號(hào)通路中重要分子表達(dá)量下降，而雌二醇能通過促進(jìn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活下游靶基因BMP-2，上調(diào)基因表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖分化，促進(jìn)骨形成，抑制骨破壞，調(diào)節(jié)骨重建系統(tǒng)的平衡，提高骨密度和骨生物力學(xué)性能，改善骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，從而起到抗PMO作用。同樣黃佳等[15]通過細(xì)胞研究表明雌二醇可通過ERα/GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路調(diào)節(jié)小鼠成骨細(xì)胞增殖。魏雙雙等[16]的研究表明雌激素可能通過上調(diào)Wnt16、β-catenin、OPG表達(dá)，下調(diào)RANKL表達(dá)，發(fā)揮對(duì)骨組織的保護(hù)作用，起到抗骨質(zhì)疏松作用。

綜上所述，雌二醇能夠通過經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路，激活BMP-2表達(dá)，促進(jìn)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠成骨細(xì)胞的增殖、分化，增加骨密度，提高骨生物力學(xué)性能，改善骨組織微觀結(jié)構(gòu)，具有抗PMO的作用。然而雌激素抗PMO涉及多條信號(hào)通路，各通路之間交互作用，對(duì)單一信號(hào)通路的分析是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，在后續(xù)研究中，筆者將對(duì)其他相關(guān)的信號(hào)通路進(jìn)行探討。同時(shí)，對(duì)此類藥物的研究還涉及給藥方式、給藥劑量、藥物療程以及藥物安全性等諸多問題，還需進(jìn)行更加深入的研究分析與全面評(píng)估。