馬銀鵬 孔祥輝 韓增華 馬慶芳 戴肖東 劉佳寧 張介馳 張丕奇

（黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，黑龍江哈爾濱150010）

黑木耳（Auricularia heimuer）[1]營(yíng)養(yǎng)豐富，具有藥用價(jià)值，是一種珍貴的食藥用菌[2]。東北地區(qū)由于其獨(dú)特的冷涼氣候特點(diǎn)，黑木耳色黑、肉厚、品質(zhì)佳，受到消費(fèi)者青睞[3]。目前，黑木耳栽培以全光地?cái)[栽培模式為主[4]，環(huán)境的可控性差，整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期間時(shí)常受到極端非生物脅迫影響。

溫度、光照、濕度等環(huán)境因子均會(huì)影響食用菌菌絲體的正常生長(zhǎng)，從而影響食用菌的產(chǎn)量和品質(zhì)[5]。溫度是影響食用菌生長(zhǎng)發(fā)育最活躍、最重要的因素[6]。高溫是導(dǎo)致食用菌產(chǎn)量降低和品質(zhì)下降的重要非生物脅迫因子之一，生物體對(duì)高溫脅迫的耐受性是其賴以生存和正常發(fā)育的重要特性[7-8]。

高溫脅迫下，氧化應(yīng)激反應(yīng)引起活性氧（ROS）增加，ROS 氧化生物膜，形成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，損傷細(xì)胞[9]。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）等是重要的細(xì)胞保護(hù)酶系統(tǒng)，抗氧化酶作用尤為突出[10]。劉秀明等[11]對(duì)肺形側(cè)耳高溫脅迫生理的研究表明，高溫脅迫導(dǎo)致菌絲內(nèi)ROS 顯著增加，抗氧化酶類活性均升高。郭敬等[12]研究發(fā)現(xiàn)高溫（35 ℃）和低溫（4 ℃）脅迫下白玉菇、杏鮑菇、真姬菇三種食用菌菌絲酶活性的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律各有差異。黑木耳胞外酶活性研究已有報(bào)道，王玉江等[13]研究了黑木耳栽培過程中胞外酶活性變化；李紅等[14]研究了黑木耳栽培過程中抗霉能力及胞外酶活性變化。但是對(duì)于黑木耳高溫脅迫條件下黑木耳酶活性變化研究報(bào)道較少。

為些，筆者研究高溫脅迫對(duì)黑木耳菌絲體POD、SOD、CAT 保護(hù)酶活性和MDA 含量的影響，以探討黑木耳菌絲體對(duì)高溫的生理反應(yīng)，為耐高溫黑木耳菌株篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黑木耳菌株為DH2、10 號(hào)。DH2 菌株菌絲體較耐高溫，44 ℃熱激4 h后仍能恢復(fù)生長(zhǎng)；10號(hào)菌株菌絲體不耐高溫，44 ℃熱激4 h 后不能恢復(fù)生長(zhǎng)。黑木耳菌株保藏于黑龍江省科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心。

1.2 菌絲培養(yǎng)

黑木耳菌株在培養(yǎng)皿中活化，活化后用1 cm 打孔器打孔，取接種塊接種于加鋪玻璃紙的PDA 平板上，28 ℃避光培養(yǎng)5 d、7 d 時(shí)分別收集菌絲體，培養(yǎng)7 d 時(shí)轉(zhuǎn)移到44 ℃培養(yǎng)箱中熱激4 h 后收集菌絲體，然后轉(zhuǎn)移到28 ℃培養(yǎng)箱中恢復(fù)培養(yǎng)3 d、5 d 后分別收集菌絲體。菌絲體分別收集于1.5 mL 離心管中，液氮速凍后于-70 ℃下保存。

1.3 酶活性測(cè)定

POD、SOD、CAT 活性及 MDA 含量均采用試劑盒測(cè)定，具體操作步驟按照試劑盒說明書。試劑盒購(gòu)自蘇州格銳思生物科技有限公司。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 16 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析方法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫對(duì)供試黑木耳菌株菌絲體POD 活性影響

由圖1可知，DH2菌株菌絲培養(yǎng)5 d、7 d，POD活性變化不明顯。菌絲44 ℃熱激4 h 后，POD 活性呈先升高后降低趨勢(shì)。高溫脅迫后菌絲體POD 活性與培養(yǎng)7 d 時(shí)酶活性相比差異不顯著（P＞0.05）。但是菌絲體恢復(fù)3 d（培養(yǎng)10 d）時(shí)，POD 活性顯著升高，與熱激前酶活性相比差異顯著（P＜0.05）；菌絲體恢復(fù)5 d（培養(yǎng)12 d）時(shí)，POD活性下降。

10號(hào)菌株菌絲培養(yǎng)5 d、7 d時(shí)，POD活性變化不明顯。菌絲44 ℃熱激4 h 后，POD 活性呈先升高后降低趨勢(shì)。高溫脅迫后菌絲體POD 活性與培養(yǎng)7 d時(shí)酶活性相比差異顯著（P＜0.05）。但是菌絲體恢復(fù)3 d（培養(yǎng) 10 d）、5 d（培養(yǎng) 12 d）時(shí)，POD 活性逐漸下降。

圖1 高溫脅迫對(duì)供試黑木耳菌株菌絲體POD活性影響

2.2 高溫脅迫對(duì)供試黑木耳菌株菌絲體SOD 活性影響

由圖2可知，DH2菌株菌絲培養(yǎng)5 d、7 d時(shí)，SOD活性變化不明顯。菌絲44 ℃熱激4 h 后，SOD 活性顯著升高，菌絲體恢復(fù)時(shí)SOD 活性降低。高溫脅迫后菌絲體SOD 活性與培養(yǎng)7 d 時(shí)酶活性相比差異顯著（P＜0.05）。但是菌絲體恢復(fù)3 d（培養(yǎng)10 d）、5 d（培養(yǎng)12 d）時(shí)，SOD活性下降至高溫脅迫前水平。

圖2 高溫脅迫對(duì)供試黑木耳菌株菌絲體SOD活性影響

10號(hào)菌株菌絲培養(yǎng)5 d、7 d時(shí)，SOD活性變化不明顯。菌絲44 ℃熱激4 h 后，SOD 活性顯著升高，菌絲體恢復(fù)時(shí)，SOD 活性降低。高溫脅迫后菌絲體SOD 活性與培養(yǎng)7 d 時(shí)酶活性相比差異顯著（P＜0.05）。但是菌絲體恢復(fù)3 d（培養(yǎng)10 d）、5 d（培養(yǎng)12 d）時(shí)，SOD活性下降至高溫脅迫前水平。

2.3 高溫脅迫對(duì)供試黑木耳菌株菌絲體CAT 活性影響

由圖 3 可知，DH2 菌絲培養(yǎng) 5 d 和 7 d 時(shí)，CAT 活性變化不明顯。菌絲44 ℃熱激4 h 后，CAT 活性升高，菌絲體恢復(fù)時(shí)CAT 活性逐漸降低。高溫脅迫后菌絲體CAT 活性與培養(yǎng)7 d 時(shí)酶活性相比差異顯著（P＜0.05）。但是菌絲體恢復(fù)3 d（培養(yǎng)10 d）和5 d（培養(yǎng)12 d）時(shí)，CAT活性呈下降趨勢(shì)。

10 號(hào)菌絲培養(yǎng) 5 d 和 7 d 時(shí)，CAT 活性變化不明顯。菌絲44 ℃熱激4 h 后，CAT 活性升高，菌絲體恢復(fù)時(shí)，CAT 活性逐漸降低。高溫脅迫后菌絲體CAT活性與培養(yǎng)7 d 時(shí)酶活性相比差異顯著（P＜0.05）。但是菌絲體恢復(fù)3 d（培養(yǎng)10 d）、5 d（培養(yǎng)12 d）時(shí)，CAT活性呈下降趨勢(shì)。

圖3 高溫脅迫對(duì)供試黑木耳菌株菌絲體CAT活性影響

2.4 高溫脅迫對(duì)供試黑木耳菌株菌絲體MDA含量影響

由圖 4 可知，DH2 菌株菌絲培養(yǎng) 5 d、7 d 時(shí)，MDA 含量變化不明顯。菌絲44 ℃熱激4 h 后，MDA含量上升，菌絲體恢復(fù)時(shí)MDA含量顯著升高后又降低。高溫脅迫后菌絲體MDA含量與培養(yǎng)7 d時(shí)含量相比差異不顯著（P＞0.05）。但是菌絲體恢復(fù)3 d（培養(yǎng)10 d），MDA 含量顯著上升，與培養(yǎng)7 d 含量相比差異顯著（P＜0.05）。

10 號(hào)菌株菌絲培養(yǎng) 5 d、7 d，MDA 含量變化不明顯。菌絲44 ℃熱激4 h 后，MDA 含量顯著升高，菌絲體恢復(fù)時(shí)，MDA 含量降低。高溫脅迫后菌絲體MDA 含量與培養(yǎng)7 d 時(shí)含量相比差異顯著（P＜0.05）。但是菌絲體恢復(fù)3 d（培養(yǎng)10 d）和5 d（培養(yǎng)12 d）時(shí)，MDA含量與高溫脅迫前基本一致。

圖4 高溫脅迫對(duì)供試黑木耳菌株菌絲體MDA含量影響

3 小結(jié)與討論

在食用菌生長(zhǎng)發(fā)育過程中，高溫能導(dǎo)致食用菌菌絲細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)損傷和生理代謝紊亂，從而造成食用菌菌絲生長(zhǎng)停滯甚至死亡。高溫脅迫下，細(xì)胞內(nèi)活性氧增加，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷，多種保護(hù)酶發(fā)生應(yīng)激變化，以緩解高溫脅迫造成的傷害[15]。研究發(fā)現(xiàn)，黑木耳菌絲44 ℃熱激處理4 h后，菌絲POD活性、SOD 活性、CAT 活性、MDA 含量上升。筆者研究與戚元成等[16]對(duì)40 ℃高溫脅迫下糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）菌絲丙二醛含量、超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性變化研究一致。因此，黑木耳菌絲中丙二醛含量、菌絲保護(hù)酶活性提高，能有效地清除各種活性氧基團(tuán)，防止這些基團(tuán)對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)的損壞，這對(duì)于維持生物細(xì)胞自由基處于較低水平有重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，供試兩個(gè)黑木耳菌株菌絲高溫脅迫后，菌絲體保護(hù)酶響應(yīng)時(shí)間有差異：DH2 菌株菌絲高溫脅迫后，SOD 活性、CAT 活性迅速上升，但是POD 活性、MDA 含量對(duì)高溫脅迫響應(yīng)較慢，POD 活性、MDA含量在菌絲恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)升高。10號(hào)菌株菌絲高溫脅迫后，POD 活性、SOD 活性、CAT 活性和MDA 含量均迅速升高，表明10 號(hào)菌株對(duì)高溫脅迫較敏感。

黑木耳菌絲高溫耐受性與菌絲保護(hù)酶響應(yīng)快慢是否有相關(guān)性需要進(jìn)一步研究，另外后續(xù)可開展高溫脅迫后熱激蛋白表達(dá)相關(guān)研究。