丘福保，盧麗明，林勝軍，劉國平

中山市疾病預防控制中心 (中山 528400)

真菌毒素(mycotoxins)是一類由絲狀真菌在一定的環(huán)境條件下產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，已確認化學結(jié)構(gòu)的真菌毒素有300多種，如黃曲霉毒素、伏馬毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、T-2和HT-2毒素等，大部分被證實具有致癌、致畸和致突變作用，其中黃曲霉毒素B1被公認為市目前致癌作用最強的天然物質(zhì)之一[1]。真菌毒素對谷物及其制品的污染具有普遍性，是比合成污染物、植物毒素、食品添加劑或農(nóng)藥殘留更為重要的食源性風險因子。我國現(xiàn)行食品中真菌毒素限量標準(GB 2761—2017[2])規(guī)定谷物及其制品中黃曲霉毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的最高允許限量，對其他特殊膳食用食品則有更為嚴格的要求。

真菌毒素的快速篩查多用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA)[3-4]，具有簡單快速和成本低的優(yōu)點，但定量能力差且容易出現(xiàn)假陽性情況。準確定性定量方面主要有氣相色譜法(gas chromatography，GC)[5-6]、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)[7-8]和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS)，前兩種多用于一種或同一類真菌毒素的定性或定量分析，常需要將真菌毒素衍生化處理，操作頗為復雜且靈敏度相對較低，而谷物及其制品中的真菌毒素污染往往是多種毒素同時存在，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法因靈敏度高、可以多組分同時測定而常用于多真菌毒素檢測研究[9-15]。

樣品在前處理過程中加入同位素內(nèi)標可以減小基質(zhì)效應(yīng)的影響，提取液直接稀釋后上機在結(jié)果計算時容易出現(xiàn)偏差[13]，利用固相萃取柱或免疫親和柱凈化時檢測成本較高且回收率未能全面兼顧到各真菌毒素。本研究通過優(yōu)化前處理、色譜和質(zhì)譜條件，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定谷物制品中的18種真菌毒素，可為食品安全風險監(jiān)測中多種真菌毒素檢測提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1儀器和設(shè)備

LC-30AD超高效液相色譜儀(日本SHIMADZU公司)；6500+超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源(美國AB Sciex公司)；Milli-Q Element超純水制備儀(美國Millipore公司)；千分一電子天平(感量0.001 g，日本SHIMADZU公司)；Real Mix渦旋振蕩器(德國Heidolph公司)；3-30K低溫超高速離心機(德國Sigma公司)；N-EVAP-112氮吹儀(美國Organomation公司)；FW100高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；20目樣品篩(浙江上虞市道墟五四儀器紗篩廠)。

1.1.2試劑

黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFT B1)、黃曲霉毒素G1(aflatoxin G1，AFT G1)濃度為2.00 mg/L，黃曲霉毒素B2(aflatoxin B2，AFT B2)、黃曲霉毒素G2(aflatoxin G2，AFT G2)、黃曲霉毒素M1(aflatoxin M1，AFT M1)濃度為0.500 mg/L，赭曲霉毒素A(orchatoxin A，OTA)濃度為10.0 mg/L，伏馬毒素B1(fumonisin B1，F(xiàn)B1)、伏馬毒素B2(fumonisin B2，F(xiàn)B2)、伏馬毒素B3(fumonisin B3，F(xiàn)B3)、去環(huán)氧脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deepoxy deoxynivalenol，DOM)濃度為50.0 mg/L，T-2毒素(T-2 toxin，T-2)、HT-2毒素(HT-2 toxin，HT-2)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)、3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-acetyl-deoxynivalenol，3-AcDON)、15-乙?；撗跹└牭毒┐?15-acetyl-deoxynivalenol，15-AcDON)、瓜萎鐮刀菌烯醇(nivalenol，NIV)、鐮刀菌烯酮(fusarenon-X，F(xiàn)us X)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)濃度為100 mg/L，以及同位素內(nèi)標U-[13C17]-黃曲霉毒素B1、U-[13C17]-黃曲霉毒素B2、U-[13C17]-黃曲霉毒素G1、U-[13C17]-黃曲霉毒素G2、U-[13C17]-黃曲霉毒素M1濃度為0.500 mg/L，U-[13C20]-赭曲霉毒素A、U-[13C34]-伏馬毒素B2、U-[13C34]-伏馬毒素B3濃度為10.0 mg/L，U-[13C24]-T-2毒素、U-[13C22]-HT-2毒素、U-[13C34]-伏馬毒素B1、U-[13C15]-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、U-[13C15]-3-乙?；撗跹└牭毒┐?、U-[13C15]-瓜萎鐮刀菌烯醇、U-[13C18]-玉米赤霉烯酮濃度為25.0 mg/L(純度均大于99%，奧地利Romer Labs公司)；甲醇、乙腈、甲酸(色譜純，德國Merck公司)；實驗用水均為超純水。

1.2 方法

1.2.1標準溶液的配制

分別移取一定體積上述各標準儲備液配制適宜的混合標準中間液和混合同位素內(nèi)標中間液，然后用20%乙腈-水溶液逐級稀釋，混合中間液和標準曲線濃度如表1所示，現(xiàn)配現(xiàn)用。

表1 18種真菌毒素混合中間液和標準曲線濃度

1.2.2樣品前處理

稱取2 g(精確至0.001 g)經(jīng)24 000 r/min高速粉碎并過20目樣品篩(孔徑0.850 mm)的谷物制品樣品于50 mL塑料離心管中，加入10 mL乙腈-水-甲酸溶液(80∶19∶1，v/v/v)渦旋振蕩提取30 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液2 mL氮吹濃縮至干，加入50 μL同位素內(nèi)標混合中間液和950 μL 20%乙腈水溶液溶解殘渣后轉(zhuǎn)入1.5 mL帶蓋離心管中14 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm水系微孔濾膜后上機測定。

1.2.3儀器條件

色譜：色譜柱，Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；進樣量10 μL；流動相，正離子模式以0.1%甲酸水溶液為水相，負離子模式以超純水為水相(A)，乙腈為有機相(B)；梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序

質(zhì)譜：電噴霧離子(electrospray ionization，ESI)源：正離子、負離子分別掃描；多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)；離子源溫度：500 ℃；氣簾氣：9 psi；碰撞氣：30 psi；電噴霧電壓，正離子模式5 000，負離子模式-4 500；霧化氣：40 psi；輔助氣：40 psi。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

通過針泵對18種真菌毒素的標準溶液進行流動注射分析，分別在ESI+和ESI-離子化模式下進行全掃描(Q1 Scan)選擇合適的母離子，然后在一定的碰撞能量下掃描碎片離子(Product Ion Scan)，選擇相對豐度最高的碎片離子作為定量離子，次高的作為定性離子，在多反應(yīng)監(jiān)測模式(multi-reaction monitoring，MRM)再優(yōu)化各離子對的去簇電壓(declustering potential，DP)和碰撞能量(collision energy，CE)。大部分真菌毒素以[M+H]+或[M-H]-作為母離子，而T-2、HT-2及其相應(yīng)的同位素內(nèi)標則以[M+Na]+離子響應(yīng)較高，得到18種真菌毒素及其內(nèi)標的質(zhì)譜參數(shù)和色譜保留時間t見表3。

表3 18種真菌毒素及15種內(nèi)標的質(zhì)譜參數(shù)

2.2 色譜條件的優(yōu)化

本試驗考察了超純水、0.1%甲酸水溶液、5 mmol/L乙酸銨溶液和含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液作為水相與甲醇、乙腈作為有機相的不同組合對各真菌毒素離子化效率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正離子模式下甲酸的濃度加大時伏馬毒素的響應(yīng)靈敏度隨之升高，而黃曲霉毒素則剛好相反；乙酸銨的加入對大部分真菌毒素的峰形沒有明顯改善作用；乙腈作為有機相時比甲醇洗脫能力強，峰形較窄且總分析時間相應(yīng)縮短。因此，最終選擇乙腈作為有機相，0.1%甲酸水作為正離子模式水相，超純水作為負離子模式水相。

本試驗還分別考察了Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)、Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)和Waters ACQUITY UPLC CSH C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)3種色譜柱對18種真菌毒素的分離效果。結(jié)果顯示HSS T3分離效果優(yōu)于另外兩種色譜柱，特別是對同分異構(gòu)體FB2和FB3的分離。濃度點5的11種正離子總離子流色譜圖和7種負離子總離子流色譜圖如圖1和圖2。

注：真菌毒素及其內(nèi)標按出峰時間順序依次為：1.AFTM1；2.AFTG2；3.FB1；4.AFTB2；5.AFTG1；6.AFTB1；7.FB3；8.HT-2；9.FB2；10.T-2；11.OTA。

注：真菌毒素及其內(nèi)標按出峰時間順序依次為：1.NIV；2.DON；3.DOM；4.Fux X；5.15-AcDON；6.3-AcDON；7.ZEN。

2.3 前處理條件的優(yōu)化

乙腈的極性強于甲醇，文獻中多數(shù)用乙腈-水溶液提取樣品中的真菌毒素，且少量甲酸的加入有利于FBs和OTA等含羥基化合物的提取[13]，本試驗以掛面樣品作為本底考察了不同比例的乙腈-水-甲酸溶液對提取效率的影響。結(jié)果表明，隨著提取溶劑中乙腈比例的提高，各真菌毒素的提取回收率有相對集中的趨勢。乙腈-水比例在80%時，多數(shù)真菌毒素的提取回收率較為合適。最終選擇提取溶劑為乙腈-水-甲酸(80∶19∶1，v/v/v)。

2.4 方法學驗證

2.4.1線性關(guān)系、檢出限和定量限

按1.2.1方法配制混合標準溶液系列，以同位素內(nèi)標法定量。以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)分別計算各真菌毒素的檢出限和定量限，稱樣量以2 g計，結(jié)果如表4所示。

表4 18種真菌毒素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.4.2回收率和精密度

選取掛面、方便面和米粉三種不同基質(zhì)的樣品分別加入線性范圍內(nèi)低、中、高3個濃度水平的18種真菌毒素混合標準溶液，按1.2.2方法處理后上機測定，每個加標水平平行試驗3次?？鄢龢悠繁镜字岛笥嬎愀髯缘钠骄訕嘶厥章屎褪覂?nèi)精密度，結(jié)果見表5。

表5 不同樣品基質(zhì)中18種真菌毒素的平均回收率和室內(nèi)精密度(n=3)

2.4.3準確度

本試驗測定了幾份購于Romer labs公司的玉米粉/小麥粉質(zhì)控樣，結(jié)果如表6所示，目標真菌毒素的測定值均在質(zhì)控樣的給出的參考值范圍內(nèi)。

表6 質(zhì)控樣品檢測結(jié)果(n=2)

2.5 實際樣品檢測

采用優(yōu)化后的前處理條件和UPLC-MS/MS方法檢測市售的掛面、方便面和米粉各10份。結(jié)果顯示，方便面中檢出有AFTB1、FB1、DON和NIV，掛面和米粉檢出有DON和NIV，其他真菌毒素均未檢出，其中有2份掛面和1份方便面的DON含量超過了限量值標準(1 000 μg/kg)。檢測結(jié)果還顯示當DON含量較大時常常NIV也會隨之檢出，且DON的含量大概是NIV的十幾倍。說明DON對谷物制品的污染具有普遍性，可能與農(nóng)作物的儲存和加工環(huán)境有一定的關(guān)系。

3 結(jié)論

本試驗通過優(yōu)化色譜、質(zhì)譜條件結(jié)合提取后濃縮和同位素內(nèi)標校正技術(shù)，建立了分析谷物制品中18種真菌毒素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。該方法具有靈敏度高、前處理成本較低，適用于多種真菌毒素定性和定量檢測，能夠滿足日常食品安全風險監(jiān)測的檢測需求。