米智，劉荔貞，武曉紅

(1.山西大同大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 大同 037009；2.山西大同大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，山西 大同 037009)

沙棘(HippophaerhamnoidesLinn., sea buckthorn)為胡頹子科(Elaeagnaceae)沙棘屬(Hippophae)多年生落葉灌木或小喬木，又名醋柳、黑刺等，廣泛分布在歐亞地區(qū)。我國(guó)沙棘分布面積約占全球的95%以上，是沙棘資源的主要生產(chǎn)國(guó)，素有“沙棘王國(guó)”之稱[1]，多分布于華北(山西)、西北(甘肅)、西南(四川)等干旱地區(qū)[2]。沙棘歷來(lái)都是慣用的蒙、藏藥材，作為一種藥食同源的植物被廣泛關(guān)注，藏醫(yī)名著《四部醫(yī)典》、《月王藥疹》，蒙藥名著《無(wú)誤蒙藥鑒》，清代藥學(xué)經(jīng)典《晶珠本草》及《中國(guó)藥典》均對(duì)沙棘的藥效做了記錄，其具有止咳祛痰、消食化滯、活血散淤、壯陰升陽(yáng)等功效[3]。沙棘中富含揮發(fā)油類、微量元素和黃酮類化合物等多種具有生物功能和活性的營(yíng)養(yǎng)成分，具有較高的醫(yī)用保健價(jià)值，享有“生命能源”、“綠色黃金”和“維C之王”等美譽(yù)[4]。

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，在沙棘中已分離出近40種黃酮類化合物，豐富的黃酮含量使沙棘具有防癌、抗癌、提升心腦血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、降血糖、降血脂的功效以及抗輻射、抗氧化、抗抑郁、抗菌消炎、保護(hù)肝臟等多種藥理作用[5-8]。人類的衰老和許多疾病與自由基的氧化反應(yīng)有關(guān)[9]，而黃酮又是一種抗氧化活性物質(zhì)，能夠減少基體的氧化損傷[10]。沙棘中黃酮類物質(zhì)具有多種較高的藥理價(jià)值，也是功能性食品添加劑，如：天然甜味劑、天然風(fēng)味增強(qiáng)劑、天然色素等[11]。

植物黃酮類化合物具有廣泛的藥理活性，已在諸多行業(yè)得到廣泛應(yīng)用[12]，提取黃酮類物質(zhì)的工藝有回流提取法、超聲波提取法、微波提取法、超臨界流體萃取法、閃式提取法等方法[13-15]，本文采用索氏提取法，因其具有能耗低、操作簡(jiǎn)便、得率高等優(yōu)點(diǎn)而被實(shí)驗(yàn)室廣泛采用。

因此，為了促進(jìn)沙棘資源的開(kāi)發(fā)利用和深入研究，本文以沙棘果粉為原料，利用響應(yīng)面法優(yōu)化索氏提取黃酮工藝，為更好地開(kāi)發(fā)和利用沙棘等天然資源提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘果粉：購(gòu)于山西呂梁文水縣醋柳山生物科技公司；硝酸鋁、蘆丁、亞硝酸鈉、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉等：購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

精密電子天平、數(shù)顯恒溫水浴鍋、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、索氏提取器、電熱套、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱等。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，加少量95%乙醇，搖勻，在超聲波輔助下使之充分溶解，用60%乙醇定容至50 mL，得0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液[16]。取6個(gè)干燥潔凈的25 mL容量瓶，按表1順序加入試劑。

表1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作Table 1 The making of rutin standard curve

以0號(hào)容量瓶為空白對(duì)照，在510 nm處用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸光值，測(cè)3次求平均值，做回歸處理。

1.3.2 沙棘果粉處理及黃酮提取工藝流程

將沙棘果粉放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，在40 ℃下干燥至恒重，稱重，用濾紙分裝小包，以乙醇為溶劑，在索氏提取器中回流提取，定容待測(cè)。

精確量取1 mL提取液作為待測(cè)液，方法同1.3.1，在510 nm處測(cè)吸光值，做3組平行試驗(yàn)求平均值，代入線性回歸方程，得到沙棘果粉總黃酮的含量(%)。

式中：C為沙棘果粉總黃酮濃度(mg/mL)；N為稀釋的倍數(shù)；V為提取液總體積(mL)；W為試驗(yàn)樣品的質(zhì)量(g)。

1.3.3 沙棘果粉總黃酮提取工藝的單因素試驗(yàn)

參照米智等[17]的方法，準(zhǔn)確稱取2 g沙棘果粉，在料液比為1∶25 (g/mL)、提取時(shí)間為2.0 h、提取次數(shù)為2次的前提下，設(shè)置不同乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%)對(duì)沙棘果粉總黃酮提取量的影響；在乙醇濃度為70%、提取時(shí)間為2.0 h、提取次數(shù)為2次的前提下，設(shè)置不同料液比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35)對(duì)沙棘果粉總黃酮提取量的影響；在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、料液比為1∶25、提取次數(shù)為2次的前提下，設(shè)置不同提取時(shí)間(1.0，1.5，2，2.5，3.0 h)對(duì)沙棘果粉總黃酮提取量的影響；在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、料液比為1∶25、提取時(shí)間為2.0 h的前提下，設(shè)置不同提取次數(shù)(1，2，3，4，5次)對(duì)沙棘果粉總黃酮提取量的影響。每個(gè)單因素試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行方差分析。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

根據(jù)沙棘果粉總黃酮提取工藝中各個(gè)單因素試驗(yàn)結(jié)果可得，在選取的4個(gè)因素中分別選取3個(gè)對(duì)沙棘果粉黃酮提取量影響最大的水平，以黃酮提取量為考察目標(biāo)，運(yùn)用Design-Expert V8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，確定建立響應(yīng)面試驗(yàn)方案，求得回歸方程預(yù)測(cè)模型，并確定沙棘的黃酮最佳提取工藝。

1.3.5 沙棘果粉總黃酮提取工藝的驗(yàn)證性試驗(yàn)

為了更好地驗(yàn)證索氏提取法提取沙棘果粉總黃酮的可靠性和合理性，在響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了3次平行驗(yàn)證性試驗(yàn)，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以蘆丁濃度(C，m/V)為橫坐標(biāo)，吸光值OD510為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性回歸方程為：Y=9.017X-0.102，R2=0.991。

2.2 沙棘果粉總黃酮提取工藝的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對(duì)提取結(jié)果的影響

圖1 乙醇濃度對(duì)沙棘樣品黃酮量的影響Fig.1 Effect of ethanol content on the flavonoids amount of Hippophae rhamnoides Linn. powder

由圖1可知，當(dāng)乙醇濃度低于70%時(shí)，沙棘果粉黃酮提取量隨著乙醇濃度增大而提高；在乙醇濃度為70%時(shí)黃酮提取量達(dá)到最大，約為2.13%；當(dāng)乙醇濃度超過(guò)70%后，隨著乙醇濃度的提高，黃酮提取量反而降低。因此在做響應(yīng)面試驗(yàn)時(shí)，選取乙醇濃度3個(gè)水平分別為60%、70%和80%。

2.2.2 料液比對(duì)提取結(jié)果的影響

圖2 料液比對(duì)沙棘樣品黃酮量的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the flavonoids amount of Hippophae rhamnoides Linn. powder

由圖2可知，沙棘果粉黃酮提取量隨著料液比的增大而提高，當(dāng)料液比為1∶30時(shí)，沙棘果粉黃酮提取量達(dá)到最大值，約為2.05%;而料液比為1∶25時(shí)，黃酮提取量為2.04%。當(dāng)料液比繼續(xù)增大時(shí)，黃酮提取量反而降低。因此在做響應(yīng)面試驗(yàn)時(shí)，選取料液比3個(gè)水平為1∶20、1∶25和1∶30。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)提取結(jié)果的影響

圖3 提取時(shí)間對(duì)沙棘樣品黃酮量的影響Fig.3 Effect of extraction time on the flavonoids amount of Hippophae rhamnoides Linn. powder

由圖3可知，當(dāng)提取時(shí)間不足2.5 h時(shí)，沙棘果粉黃酮提取量隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而提高；且提取2.5 h時(shí)黃酮提取量達(dá)到最大值，約為1.94%；提取時(shí)間為2.0 h時(shí)，黃酮提取量為1.93%。隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，沙棘果粉黃酮提取量反而有所降低。因此在做響應(yīng)面試驗(yàn)時(shí)，選取提取時(shí)間3個(gè)水平為1.5，2.0，2.5 h。

2.2.4 提取次數(shù)對(duì)提取結(jié)果的影響

圖4 提取次數(shù)對(duì)沙棘樣品黃酮量的影響Fig.4 Effect of extraction times on the flavonoids amount of Hippophae rhamnoides Linn. powder

由圖4可知，當(dāng)提取次數(shù)在1～4次時(shí)，沙棘果粉黃酮提取量隨著提取次數(shù)的增加而提高；且提取4次時(shí)黃酮提取量達(dá)到最大值，約為2.10%；提取2～4次時(shí)，沙棘黃酮量比較相近。當(dāng)提取次數(shù)再增加時(shí)，黃酮提取量有所降低。因此在做響應(yīng)面試驗(yàn)時(shí)，選取提取次數(shù)3個(gè)水平為1，2，3次。

2.3 回歸模型的建立及其分析

響應(yīng)面試驗(yàn)方案見(jiàn)表2，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平的確定Table 2 Determination of factors and levels of response surface methodology

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果表Table 3 The results of response surface methodology

續(xù) 表

建立沙棘果粉黃酮提取工藝條件的回歸模型方程，獲得本試驗(yàn)考察指標(biāo)(黃酮提取量)的響應(yīng)值(Y)對(duì)各自變量A(乙醇濃度)、B(料液比)、C(提取時(shí)間)和D(提取次數(shù))的二次多項(xiàng)式回歸方程：沙棘果粉黃酮提取量Y=-23.08167+0.40608A+0.4815B+4.06167C+0.8575D+3.0E-4AB+2.5E-3AC+8.0E-3AD-0.02BC-0.0145BD-0.125CD-3.05E-3A2-8.8E-3B2-0.875C2-0.18375D2。

以沙棘果粉黃酮提取量為考察指標(biāo)，對(duì)試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行方差分析和對(duì)模型系數(shù)進(jìn)行顯著性分析，見(jiàn)表4。

表4 二次模型的方差分析Table 4 Variance analysis of the quadratic model

由表4可知，二次項(xiàng)回歸模型在統(tǒng)計(jì)學(xué)上呈極顯著(P<0.01)，說(shuō)明該提取黃酮試驗(yàn)?zāi)Ｐ途哂薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且通過(guò)P值可知模型中變量A、D、A2、B2、C2和D2對(duì)提取量的影響極顯著，交互項(xiàng)AD和BD對(duì)模型的影響顯著，說(shuō)明試驗(yàn)因素與響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，一次項(xiàng)、二次項(xiàng)、交互項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值均有很大的關(guān)系；失擬項(xiàng)結(jié)果為不顯著(P=0.1299>0.05)，說(shuō)明該試驗(yàn)?zāi)Ｐ途哂休^好的擬合度，方程模型的殘差可能來(lái)源于試驗(yàn)過(guò)程中的隨機(jī)誤差。模型的RAdj2=0.9149，說(shuō)明試驗(yàn)可靠、誤差小，該模型能解釋91.49%的響應(yīng)值變化，R2為0.9574，表明提取量的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合度，該模型可預(yù)測(cè)沙棘果粉黃酮提取的實(shí)際情況。在試驗(yàn)所選取的各因素中，乙醇濃度>提取次數(shù)>料液比>提取時(shí)間。

圖5 提取次數(shù)和料液比對(duì)沙棘果粉黃酮提取量的響應(yīng)面圖(A)和等高線圖(B)Fig.5 Response surface map (A) and contour map (B) of effect of extraction times and ratio of solid to liquid on the extraction amount of flavonoids from Hippophae rhamnoides Linn. powder

圖6 乙醇濃度和提取次數(shù)對(duì)沙棘果粉黃酮提取量的響應(yīng)面圖(A)和等高線圖(B)

通過(guò)三維響應(yīng)面圖和二維等高線圖分析顯示，隨著乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)的增大或延長(zhǎng)，沙棘果粉黃酮提取量也隨之增大，但當(dāng)乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)增大或延長(zhǎng)到一定程度后，黃酮提取量有下降的趨勢(shì)(見(jiàn)圖5和圖6)，提取次數(shù)和料液比、乙醇濃度和提取次數(shù)的交互作用對(duì)模型影響顯著，其余均不顯著，從等高線圖中可以看出其橢圓程度和疏密程度，與模型回歸中的方差分析一致。

2.4 最佳提取條件的確定

由響應(yīng)面法試驗(yàn)分析數(shù)據(jù)可得出沙棘果粉中黃酮的最佳提取取工藝：乙醇濃度為77.4%，料液比為1∶24.46，提取時(shí)間為1.98 h，提取次數(shù)為2.38次，最佳提取量為2.22%?？紤]實(shí)驗(yàn)室操作的可行性，修正提取工藝條件為乙醇濃度75%、料液比1∶25、提取時(shí)間2.0 h和提取次數(shù)2次。

2.5 優(yōu)化條件的驗(yàn)證性試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)篩選出沙棘果粉黃酮提取的最佳工藝(見(jiàn)2.4)，進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，驗(yàn)證響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。測(cè)得沙棘果粉黃酮得率，見(jiàn)表5。

表5 驗(yàn)證性試驗(yàn)測(cè)定沙棘果粉黃酮提取量Table 5 Confirmatory experiment for testing the extraction amount of flavonoids from Hippophae rhamnoides Linn. powder %

由表5可知，3組平行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的RSD為2.34%，滿足要求，得出該提取工藝沙棘果粉黃酮提取量較為穩(wěn)定。

3 結(jié)論

由響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析可知，索氏提取法提取沙棘黃酮的最佳工藝為：乙醇濃度為75%，料液比為1∶25，提取時(shí)間為2.0 h和提取次數(shù)為2次。影響程度為：乙醇濃度>提取次數(shù)>料液比>提取時(shí)間，乙醇濃度和提取次數(shù)對(duì)沙棘黃酮提取量影響極顯著。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD較小(2.34%)，說(shuō)明索氏提取法提取沙棘黃酮工藝精確、可靠。響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)軐?duì)各個(gè)因素及各因素之間的交互分析得更全面、更細(xì)致，能較為準(zhǔn)確地分析出因素間的最佳組合，試驗(yàn)穩(wěn)定、可靠，為今后研究沙棘果粉黃酮等成分的提取提供了試驗(yàn)依據(jù)。