李超， 王巍， 楊雪卿

(北京中醫(yī)醫(yī)院順義醫(yī)院 心內(nèi)科， 北京 101300)

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是多種原因?qū)е滦募〖毎麚p傷，進而引起心臟射血功能異常，最終導(dǎo)致機體代謝失衡的一種心血管系統(tǒng)終末期疾病[1-3]，患病率已達1.6%，嚴(yán)重地危害人類健康[4]。心室重構(gòu)是CHF發(fā)生發(fā)展的基本機制，主要涉及心肌細胞結(jié)構(gòu)功能的異常改變[5-6]。線粒體是心肌細胞重要的細胞器，參與了心室重構(gòu)重要的環(huán)節(jié)[7]。既往研究發(fā)現(xiàn)，正常生理狀態(tài)下心肌細胞線粒體能夠為機體提供能量，同時受損的線粒體也能夠及時被自噬吞噬處理[8]。病理狀態(tài)下，心肌細胞線粒體功能異常，自噬小體過度激活，導(dǎo)致心肌細胞中線粒體自噬的失衡[9-10]，提示心肌細胞線粒體自噬在CHF進展中發(fā)揮著重要作用。瀉肺利水合劑是由葶藶子、桑白皮、車前子、赤芍、水紅花子、生黃芪、甘草及太子參8味中藥組成，其水合劑用于治療CHF是由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院許心如教授首次提出、并進行了相關(guān)機制探討，認為其可通過“益氣活血，瀉肺利水”進而達到治療CHF的目的[10]。此外，瀉肺利水合劑可顯著提高心衰患者的生存質(zhì)量，同時具有良好的血流動力學(xué)效應(yīng)[11-12]。因此，本實驗研究擬通過構(gòu)建CHF大鼠，探究瀉肺利水合劑對治療CHF的分子作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 選取6～8周雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量200～220 g，購買于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部[SCXK(京)2018-0010]，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.1.2藥品和主要試劑 瀉肺利水合劑(葶藶子30 g、桑白皮30 g、車前子30 g、赤芍10 g、水紅花子15 g、生黃芪30 g、甘草10 g及太子參30 g)由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院合成，阿霉素(批號D1515，美國Sigma)，自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈3抗體(microtubule associated protein light chain 3，LC3)和p62抗體(美國CST)，細胞色素C氧化酶Ⅳ抗體(cytochrome c oxidase IV antibody，COX Ⅳ)、一抗和二抗稀釋液、超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，SOD)試劑盒、活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒及丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒(江蘇碧云天)。

1.1.3主要儀器 H1850高速離心機(美國Thermo Scientific)，H22539細胞渦旋儀(武漢維塞爾)，DW-86L578J -80 ℃超低溫冰箱(青島海爾)，F(xiàn)YL-YS-128 4 ℃、-20 ℃冰箱(合肥美菱)，H22820脫色搖床(江蘇盛藍)，SuPerMax-3100多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo賽默飛世爾)，SKFH-1600RW高速臺式冷凍離心機(湖南湘儀)，NIB900-FL熒光倒置顯微鏡(日本奧林巴斯)，125-0098電泳儀檢測裝置(美國Bio-Rad)，CSB-20L高純水機(美國Millipore)。

1.2 方法

1.2.1動物分組及造模 60只SD大鼠隨機分為對照組(Control組)、模型組(Model組)及瀉肺利水合劑藥物處理組(treatment組，TM組)，每組20只。Model組及TM組大鼠給予2.0 g/L阿霉素(生理鹽水配置)，以2.0 mL/kg腹腔注射、1次/周、連續(xù)6周；TM組大鼠系給予瀉肺利水合劑[10 mL/(kg·d)]灌胃，1次/d、連續(xù)6周；Control組及Model組大鼠給予等量的生理鹽水灌胃處理，1次/d、連續(xù)6周。

1.2.2心臟超聲檢測 最后一次灌胃結(jié)束后，大鼠取平臥位固定，將探頭放置于胸骨左緣，取左室長軸最大直徑M超聲記錄室間隔、左室后壁收縮末期及舒張末期心內(nèi)膜位置，于結(jié)束時采用小動物超聲儀器檢測大鼠左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic dimension，LVSD)、左室縮短分數(shù)(left ventricular fractional shortening，LVFS)、左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)，以LVFS<40%或LVEF<50%判定大鼠是否造模成功[13]；利用計算機自帶操作軟件計算LVDD、LVSD、LVFS和LVEF值。上述操作均由同一操作員進行。

1.2.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 心臟超聲檢測結(jié)束時，各組大鼠使用10%的水合氯醛按照4.5 mL/kg腹腔麻醉，采用手術(shù)剪和手術(shù)鑷打開胸腔，剪開左心耳，剪下大鼠心尖組織、生理鹽水中清洗并于液氮罐內(nèi)留存?zhèn)溆?；實驗時取各組大鼠同等質(zhì)量的心尖組織研磨成組織勻漿，采用二辛喹酸(bicinchoninic acid，BCA)法測定心尖組織蛋白質(zhì)總濃度后，分別通過ELISA檢測心尖組織中SOD、ROS和MDA含量。

1.2.4Western blot 分別取各組大鼠心尖組織進行蛋白提取并測定濃度、電泳、轉(zhuǎn)膜，孵育COX Ⅳ一抗(1 ∶1 000)、p62一抗(1 ∶1 000)和LC3(1 ∶1 000)4 ℃過夜，洗膜，室溫孵育COX Ⅳ和p62的鼠二抗，LC3的兔二抗1 h；搖床搖晃加TPBS洗滌3次，5 min/次，加顯影液顯影并拍照，蛋白表達量以各目標(biāo)條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示。

1.2.5心肌線粒體自噬 取各組大鼠包埋的心肌組織采用超薄切片機進行切片，厚度100 nm，經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬鉛染色，透射電子顯微鏡觀察心肌線粒體形態(tài)以及自噬小體并對其拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 LVEF、LVFS、LVDD和LVSD

與Control組相比，Model組與TM組大鼠的LVEF和LVFS水平明顯降低，LVDD和LVSD則明顯升高(P<0.01)；與Model組相比，TM組大鼠的LVEF和LVFS水平升高，LVDD和LVSD則降低(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠LVEF、LVFS、LVDD和Tab.1 Comparison of LVEF, LVFS, LVDD, and LVSD in each

2.2 MDA、ROS和SOD

與Control組相比，Model組和TM組大鼠心肌組織中MDA和ROS水平明顯升高、SOD水平則明顯降低(P<0.01)；與Model組相比，TM組大鼠心肌組織MDA和ROS水平降低、SOD水平則升高(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠心肌組織MDA、ROS和SOD的比較Tab.2 Comparison of MDA, ROS and SOD level of myocardial tissues in each group

2.3 心肌組織線粒體自噬相關(guān)蛋白的表達

與Control組相比，Model組大鼠心肌組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和COX Ⅳ表達均升高、p62表達明顯降低(P<0.05或P<0.01)；與Model組相比，TM組大鼠心肌組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和COX Ⅳ表達均降低、p62表達增加(P<0.05)。見圖1。

注：與Control組相比，(1)P<0.05，(2)P<0.01；(3)與Model組相比，P<0.05。圖1 各組大鼠線粒體自噬相關(guān)蛋白的表達Fig.1 The expression of mitochondrial autophagy-related proteins in each group

2.4 心肌組織線粒體自噬的形態(tài)學(xué)特征

Control組大鼠心肌線粒體形態(tài)正常、膜完整且無明顯的自噬體小泡，Model組大鼠心肌線粒體形態(tài)大小不一、膜破裂且有明顯的自噬小泡形成，TM組大鼠心肌線粒體膜部分損傷、破裂且有少量的自噬小體形成；與Control組相比，Model組大鼠心肌組織線粒體自噬數(shù)量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，但Control組與TM組比較、差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與Model組相比，TM組大鼠心肌組織線粒體自噬數(shù)量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：箭頭表示自噬小體；(1)與Control組相比，P<0.01；(2)與Model組相比，P<0.05。圖2 各組大鼠的心肌組織線粒體自噬(透射電鏡，×10 000)Fig.2 Mitophagy of myocardial tissues in each group (transmission electron microscope,×10 000)

3 討論

CHF在中醫(yī)上可以歸屬為“喘證”、“心水”、“心悸”、“痰飲”等范疇，患病率與年齡呈現(xiàn)正相關(guān)，伴隨我國人口老齡化的加劇，CHF的患病率逐年提升，已成為我國重要的公共健康問題[14]。以往研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥在治療CHF中發(fā)揮重要優(yōu)勢，主要歸為中醫(yī)藥中“中成藥制劑治療”、“中藥湯劑辯證治療”、“中藥注射劑治療”以及“其他輔助性治療”[15]。其中中藥湯劑治療在CHF患者中占據(jù)重大部分。溫陽利水、益氣活血利水、益氣養(yǎng)陰以及益氣健脾等是中藥湯劑治療CHF的主要機理[16-19]。但是目前有關(guān)中藥湯劑治療CHF的主要機制尚不清楚。因此，探尋中藥湯劑治療CHF的可能機制尤為關(guān)鍵。

瀉肺利水合劑是由葶藶子、桑白皮、車前子、赤芍、水紅花子、生黃芪、甘草及太子參共計8味中藥組成，具有典型的益氣活血利水功效[10]。研究發(fā)現(xiàn)，在氣虛水飲內(nèi)停型心衰患者中采用瀉肺利水合劑能夠有效改善患者血流動力學(xué)特征，提高患者生存質(zhì)量[11]。但是截止到目前有關(guān)瀉肺利水合劑的研究主要側(cè)重于臨床治療，有關(guān)其在體動物研究以及分子作用機制研究缺乏。本研究主通過腹腔注射阿霉素構(gòu)建CHF大鼠模型，瀉肺利水合劑10 mL/(kg·d)連續(xù)灌胃處理6周，結(jié)果顯示Model組大鼠LVEF和FS水平分別較Control組和TM組降低，但LVDD和LVSD升高(P<0.05或P<0.01)，表明瀉肺利水合劑能夠改善CHF大鼠心臟功能。

心肌組織氧化應(yīng)激和線粒體自噬在CHF中發(fā)揮重要作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)，在CHF大鼠和患者中，心肌氧化應(yīng)激水平均顯著增加[20]；抑制心肌組織氧化應(yīng)激能夠有效改善CHF大鼠癥狀[21]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Model組大鼠心肌組織MDA和ROS水平分別較Control組和TM組升高，但SOD水平降低(P<0.05或P<0.01)，提示過度氧化應(yīng)激會引起心肌細胞線粒體損傷。以往研究也證實受損的線粒體會激活細胞自噬的產(chǎn)生，導(dǎo)致心肌功能的紊亂[22-24]。在CHF大鼠模型中心肌線粒體損傷明顯加重，通過給予參葵顆粒能夠激活A(yù)MPK信號通路，改善心肌細胞線粒體自噬水平[25]。在臨床研究20例心衰患者，采用輔酶Q10補充治療能夠有效改善線粒體功能障礙，從而降低心肌氧化應(yīng)激水平[26]。為此，本研究通過Western blot檢測了線粒體自噬相關(guān)蛋白。結(jié)果顯示，Model組大鼠心肌組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和COX Ⅳ表達分別較Control組和TM組升高，p62表達降低(P<0.05或P<0.01)。透射電鏡觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Control組大鼠心肌線粒體形態(tài)正常，膜完整，無明顯的自噬體小泡；Model組大鼠心肌線粒體形態(tài)大小不一，膜破裂，有明顯的自噬小泡形成；TM組大鼠心肌線粒體膜部分損傷，破裂，且有少量的自噬小體形成。

綜上所述，瀉肺利水合劑可通過降低CHF大鼠心肌組織氧化應(yīng)激水平，抑制心肌線粒體自噬產(chǎn)生，最終改善心臟功能，從而為瀉肺利水合劑用于臨床CHF治療提供了新的理論基礎(chǔ)。