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        一種含有霉菌的茯磚茶中冠突散囊菌的計(jì)數(shù)方法

        2020-10-21 08:06:50劉相真王靜王瑾徐建峰
        中國(guó)茶葉加工 2020年3期
        關(guān)鍵詞:磚茶雜菌孟加拉

        劉相真 ,王靜,王瑾 ,徐建峰 *

        (1.中華全國(guó)供銷合作總社杭州茶葉研究院,浙江杭州 310016;2.國(guó)家茶葉質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心,浙江杭州 310016)

        近年來,隨著人們生活水平的提高,高血壓、高血脂和高血糖,已經(jīng)成為威脅人類健康的“頭號(hào)殺手”。 中國(guó)衛(wèi)生部公布的數(shù)據(jù)顯示,我國(guó)“三高”人群數(shù)量已逾3 億,死亡率近30%。茯磚茶是黑茶的一種,是以黑毛茶為原料,經(jīng)過緊壓過程而制成的再加工茶[1]。茯磚茶之前主要銷售于邊疆地區(qū)如新疆、甘肅、西藏等地,俗稱“邊茶”或“邊銷茶”,是邊疆少數(shù)民族不能缺少的常用飲品[2]。“金花”的學(xué)名為冠突散囊菌, 是散囊菌目發(fā)菌科散囊菌屬的一種真菌,是茯磚茶生產(chǎn)過程中的優(yōu)勢(shì)菌種,也是形成茯磚茶獨(dú)特品質(zhì)的主要因素[3]。 大量文獻(xiàn)表明,茯磚茶中的“金花”有較強(qiáng)的降血脂、調(diào)節(jié)糖類代謝、調(diào)節(jié)腸道菌群、提高機(jī)體免疫力、減肥等功效,因此,茯磚茶越來越受到大眾的青睞[4]。作為茯磚茶的標(biāo)志性微生物, 在茯磚茶的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和地方標(biāo)準(zhǔn)中都有要求。在1988、2002、2013 年發(fā)布的三版茯磚茶的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中, 冠突散囊菌一直是茯磚茶的理化指標(biāo)之一, 茯磚茶含有冠突散囊菌的量必須達(dá)到或高于20×104CFU/g (1988 年版為30×104CFU/g)。

        茯磚茶的加工需要經(jīng)過原料處理、渥堆汽蒸、壓制定型、發(fā)花干燥、成品包裝等工序[5],傳統(tǒng)茯磚茶生產(chǎn)過程是多種微生物共同參與發(fā)酵的過程。多名學(xué)者[6-13]長(zhǎng)期研究發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地、不同時(shí)間生產(chǎn)的茯磚茶中均有大量微生物存在。

        在 GB/T 9833.3—2013《緊壓茶 第 3 部分:茯磚茶》中規(guī)定,冠突散囊菌的檢測(cè)按GB 4789.15—2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》中的規(guī)定執(zhí)行。 實(shí)際檢測(cè)過程中,由于某些茯磚茶中其他菌類的存在, 且其生長(zhǎng)速度較冠突散囊菌快,抑制了冠突散囊菌的生長(zhǎng),導(dǎo)致檢測(cè)時(shí)不能真實(shí)得到冠突散囊菌的含量。 試驗(yàn)基于GB 4789.15—2016 方法的基礎(chǔ)上,針對(duì)含有除冠突散囊菌外存在較多雜菌的茯磚茶樣品,進(jìn)一步優(yōu)化前處理方式(不同溫度、不同培養(yǎng)基的培養(yǎng)試驗(yàn)),以尋求合適的方法對(duì)冠突散囊菌進(jìn)行科學(xué)計(jì)數(shù)。

        1 材料與方法

        1.1 主要儀器設(shè)備

        博迅100 級(jí)超凈工作臺(tái), 上海一恒BPMJ-150F 恒溫培養(yǎng)箱,上海申安DSX-280A 高壓滅菌鍋,精宏DK-S22 電熱恒溫水浴鍋,寧波立誠(chéng)LC-11L 拍打式無菌均質(zhì)器, 馬頭牌BP- II 型架盤藥物天平。

        1.2 材料與試劑

        一次性培養(yǎng)皿;無菌均質(zhì)袋;無菌錐形瓶:容量 500 mL,250 mL; 無菌吸管:1 mL (具 0.01 mL刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)、無菌平皿:直徑90 mm、無菌試管:10 mm×75 mm;孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基, 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司;察氏培養(yǎng)基,青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司;氯化鈉,西隴科學(xué)股份有限公司。

        1.3 培養(yǎng)基的制備

        孟加拉紅培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨 5.0,葡萄糖10.0,磷酸二氫鉀 1.0,硫酸鎂(無水),瓊脂 20.0,孟加拉紅 0.033,氯霉素 0.1。 察氏培養(yǎng)基(g/L):硝酸鈉3.0,磷酸氫二鉀1.0,硫酸鎂0.5,氯化鉀0.5,硫酸亞鐵0.01,蔗糖30.0,瓊脂15.0。 高鹽察氏培養(yǎng)基(g/L):在察氏培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入6%的氯化鈉。

        1.4 樣品制備

        將茯磚茶樣品在干凈無污染工作臺(tái)上剪碎并混合均勻。 稱取25 g 茯磚茶樣品于無菌均質(zhì)袋中,加入225 mL 無菌稀釋液,用拍擊式均質(zhì)器拍打 1~2 min 后, 置于水浴鍋中處理 30 min, 每隔10 min 攪拌一次,得到原液。用無菌稀釋液分別制備 10-3、10-4、10-5等各梯度的稀釋液, 用于傾注法涂布于平板。

        1.5 菌落培養(yǎng)和技術(shù)

        待瓊脂凝固后,正置平板,置28±1 ℃霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng),觀察并記錄至第7 天的結(jié)果。 選取菌落數(shù)量在10 CFU 至100 CFU 之間,且無蔓延菌落的平板來記錄冠突散囊菌總數(shù),每個(gè)梯度兩個(gè)平行樣,取平均值,以平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 冠突散囊菌的正常菌落形態(tài)

        冠突散囊菌菌落在孟加拉紅培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)如圖1 所示, 菌落呈較規(guī)則圓形, 質(zhì)地較致密,有黃色暈圈,邊緣淡黃色,近于橄欖淺黃色,中央部分顏色較深近于橄欖褐至丁香褐色, 呈現(xiàn)大量黃色菌絲,老后變成褐色,且伴有水滴狀存在。

        圖1 冠突散囊菌在孟加拉紅培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig. 1 Colony morphology of Eurotium Cristatum on Rose Bengal Medium

        2.2 國(guó)標(biāo)方法處理菌落生長(zhǎng)情況

        從圖2 中可知, 選取的茯磚茶樣品從外觀上能明顯看到除了“金花”外,同時(shí)含有其他霉菌的存在(白色毛狀)。 當(dāng)按照 GB 4789.15—2016 方法進(jìn)行培養(yǎng)時(shí),結(jié)果如圖3 所示,2 天后就已長(zhǎng)滿了毛霉, 并且旺盛生長(zhǎng)的毛霉會(huì)抑制冠突散囊菌的生長(zhǎng)。因此,國(guó)標(biāo)方法對(duì)此類樣品存在一定的局限性, 導(dǎo)致對(duì)該茯磚茶中真實(shí)存在的冠突散囊菌計(jì)數(shù)結(jié)果比實(shí)際結(jié)果少。

        圖2 茯磚茶茶樣Fig. 2 Fuzhuan Tea sample

        圖3 國(guó)標(biāo)方法處理的生長(zhǎng)情況Fig. 3 The growth of microorganism by GB 4789.15—2016

        2.3 水浴溫度處理對(duì)冠突散囊菌生長(zhǎng)的影響

        在樣品制備階段進(jìn)行一定溫度的水浴處理,可以有效滅活其他雜菌,便于冠突散囊菌的計(jì)數(shù)。因此, 做不同水浴溫度處理下冠突散囊菌在不同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況的單因素試驗(yàn), 通過觀察冠突散囊菌在培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況, 選擇合適的培養(yǎng)基和水浴溫度。

        2.3.1 孟加拉紅培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況

        樣品前處理過程中, 水浴的溫度分別設(shè)定為50 ℃、60 ℃、70 ℃,水浴后的樣品稀釋 10-4后在孟加拉紅培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況如圖4 所示。 可看到水浴溫度50 ℃處理的樣品在孟加拉紅培養(yǎng)基上的培養(yǎng)結(jié)果稍好于按照國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)的結(jié)果;水浴溫度60 ℃和70 ℃處理后的樣品在孟加拉紅培養(yǎng)基上的培養(yǎng)結(jié)果較理想,無雜菌生長(zhǎng),冠突散囊菌菌落形態(tài)較好,呈較規(guī)則圓形,且伴有水滴狀存在,但水浴溫度60 ℃處理在孟加拉紅培養(yǎng)基上的冠突散囊菌計(jì)數(shù)明顯多于水浴溫度70 ℃的處理。此結(jié)果與楊撫林等[12]對(duì)冠突散囊菌在120 ℃高溫條件下處理20 min 依舊具有生物活性較一致。

        圖4 不同處理?xiàng)l件后的樣品勻液在孟加拉紅培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況Fig. 4 Growth of sample homogenates on Rose Bengal Medium under different treatments

        2.3.2 察氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況

        水浴后的樣品稀釋10-3后在察氏培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況如圖5 所示。從圖5 中可知,不同水浴溫度處理后在察氏培養(yǎng)基上均有雜菌生長(zhǎng), 且冠突散囊菌的菌落形態(tài)不佳, 對(duì)計(jì)數(shù)有一定影響。 因此,在此實(shí)驗(yàn)方案下,察氏培養(yǎng)基不適合用于冠突散囊菌的檢測(cè)。

        2.3.3 高鹽察氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況

        水浴后的樣品在稀釋10-3后高鹽察氏培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況如圖6 所示。 水浴溫度50 ℃處理時(shí), 有少量雜菌生長(zhǎng), 冠突散囊菌菌落形態(tài)已呈現(xiàn);水浴溫度60 ℃和70 ℃處理時(shí),已無雜活菌生長(zhǎng),冠突散囊菌菌落形態(tài)較好,但水浴溫度60 ℃處理在高鹽察氏培養(yǎng)基上的冠突散囊菌計(jì)數(shù)明顯多于水浴溫度70 ℃的處理。 對(duì)比圖5 與圖6 可得,由于高鹽的作用,菌落生長(zhǎng)明顯受到抑制。

        圖5 不同處理?xiàng)l件后的樣品勻液在察氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況Fig. 5 Growth of sample homogenates on Czapek Dox Medium under different treatments

        圖6 不同處理?xiàng)l件下在高鹽察氏培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況Fig. 6 Growth of sample homogenates on Salt Czapek Dox Medium under different treatments

        2.4 最佳培養(yǎng)基的選擇

        根據(jù)單一因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可得, 經(jīng)水浴溫度50 ℃處理,有不同程度的雜菌在不同的培養(yǎng)基上生長(zhǎng);而經(jīng)水浴溫度60 ℃和70 ℃處理,能夠有效消除雜菌的干擾。水浴溫度60 ℃處理在孟加拉紅培養(yǎng)基上的冠突散囊菌計(jì)數(shù)明顯多于水浴溫度70 ℃的處理,說明水浴溫度70 ℃處理時(shí),能夠有效消除雜菌的干擾, 但對(duì)冠突散囊菌也有一定的滅活作用。 高鹽察氏培養(yǎng)基在樣品不經(jīng)水浴時(shí)也能有效抑制毛霉和根霉。 因此,對(duì)比60 ℃水浴處理后用孟加拉紅培養(yǎng)基培養(yǎng)以及高鹽察氏培養(yǎng)基培養(yǎng), 并對(duì)冠突散囊菌進(jìn)行計(jì)數(shù)以得出最佳實(shí)驗(yàn)方案,結(jié)果如圖7 和表1 所示。

        表1 不同實(shí)驗(yàn)條件下冠突散囊菌菌落總數(shù)Table 1 The total plate count of Eurotium Cristatum under different experimental conditions

        圖7 不同實(shí)驗(yàn)條件下冠突散囊菌的生長(zhǎng)情況Fig. 7 Growth of Eurotium Cristatum under different treatment conditions

        由表1 可知,以上四種方法都能較好地抑制雜菌并有效地對(duì)冠突散囊菌進(jìn)行計(jì)數(shù), 方案1 所得的冠突散囊菌最多。 雖然用高鹽察氏培養(yǎng)基也能對(duì)冠突散囊菌進(jìn)行計(jì)數(shù), 但冠突散囊菌的生長(zhǎng)受到很大的抑制,因此,方案1,即經(jīng)60 ℃水浴、0.5 h 再用孟加拉紅培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)為該茯磚茶冠突散囊菌計(jì)數(shù)的最佳方案。

        3 討論

        隨著茯磚茶保健功效的不斷證實(shí), 已經(jīng)逐步成為大眾飲品,茯磚茶中“金花”的多少又直接關(guān)系到它的保健功效的強(qiáng)弱,因此,對(duì)于“金花”計(jì)數(shù)的需求也越來越強(qiáng)烈。 文章只針對(duì)該種含雜菌較多的茯磚茶樣品進(jìn)行了試驗(yàn), 得到了最佳計(jì)數(shù)方案,當(dāng)含有其他雜菌的茯磚茶需要“金花”計(jì)數(shù)時(shí),仍需要進(jìn)行試驗(yàn)討論并解決。

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