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        外源酶對(duì)夏秋紅茶主要品質(zhì)成分影響研究

        2020-10-21 08:06:46林劍峰白建陽(yáng)吳理文張海華
        中國(guó)茶葉加工 2020年3期
        關(guān)鍵詞:浸出物單寧兒茶素

        林劍峰,白建陽(yáng),吳理文 ,張海華

        (1.松陽(yáng)縣科學(xué)技術(shù)局,浙江松陽(yáng) 323400;2.松陽(yáng)縣建陽(yáng)茶葉有限公司,浙江松陽(yáng) 323400;3.浙江正德和食品有限公司,浙江松陽(yáng) 323400;4.中華全國(guó)供銷(xiāo)合作總社杭州茶葉研究院,浙江杭州 310016)

        茶葉是我國(guó)重要的農(nóng)產(chǎn)品,近十年,我國(guó)茶產(chǎn)業(yè)規(guī)模(產(chǎn)量、面積、農(nóng)業(yè)產(chǎn)值)穩(wěn)居世界首位,茶葉產(chǎn)量從134 萬(wàn)噸增長(zhǎng)至279 萬(wàn)噸, 茶園面積從186 萬(wàn)公頃增長(zhǎng)至306 萬(wàn)公頃, 農(nóng)業(yè)產(chǎn)值從413億元增長(zhǎng)至2396 億元[1-2],發(fā)展勢(shì)頭良好。 另一方面, 茶資源供過(guò)于求的差距不斷增大, 主要表現(xiàn)在:干毛茶供過(guò)于求差額達(dá)30 余萬(wàn)噸,占比50%以上的夏秋茶的利用率低、棄采嚴(yán)重,加之茶園荒棄等現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生,導(dǎo)致茶葉、茶花、茶籽(果)、茶枝條等能用卻未用資源總量逾400 萬(wàn)噸。 中國(guó)茶產(chǎn)業(yè)總體表現(xiàn)出茶資源供過(guò)于求的差距不斷增大的趨勢(shì)、質(zhì)量效益亟待提高的突出瓶頸[3-5]。 基于此, 文章著重開(kāi)展外源酶對(duì)以夏秋茶鮮葉為原料加工的紅茶的品質(zhì)影響研究,旨在探索利用閑置、棄采夏秋茶資源, 希望通過(guò)外源酶調(diào)控小葉種紅茶品質(zhì)。

        以小葉種茶樹(shù)鮮葉為原料加工制作紅茶的工藝及產(chǎn)品已相當(dāng)成熟,如浙江杭州市的九曲紅梅、觀音紅等[6-8]?,F(xiàn)有這類(lèi)產(chǎn)品多采用春季茶鮮葉,而對(duì)小葉種茶樹(shù)的夏秋季鮮葉加工制作紅茶的加工技術(shù)和產(chǎn)品尚顯不足。少量研究報(bào)道表明,外源添加食品酶制劑能夠改善茶葉加工或深加工的效果。目前相關(guān)研究主要集中在兩方面:一是將外源酶用于茶葉深加工(速溶茶、茶飲料)的前處理,主要有單寧酶、纖維素酶、蛋白酶和果膠酶,能夠增加浸出物含量,提高速溶茶的冷溶性,進(jìn)而改善速溶茶或茶飲料的品質(zhì)[9-11];二是將外源酶用于紅茶加工中,在發(fā)酵時(shí)添加外源酶(單寧酶、纖維素酶和多酚氧化酶),能夠縮短發(fā)酵時(shí)間,改善紅茶品質(zhì),如蘇祝成等[12]利用外源單寧酶改善了夏茶滋味品質(zhì)成分和組成、包先進(jìn)等[13]在磚茶加工中加入纖維素酶對(duì)微生物發(fā)酵進(jìn)行部分替代而促進(jìn)了磚茶品質(zhì)的形成。文章突破前人研究思路,以小葉種茶樹(shù)夏秋鮮葉為原料, 探索在紅茶揉捻工序加入外源酶, 研究外源酶對(duì)紅茶主要內(nèi)質(zhì)成分的影響,為紅茶品質(zhì)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        試驗(yàn)材料為2016 年9 月采自浙江松陽(yáng)縣赤壽鄉(xiāng)婁塘村茶園白葉1 號(hào)茶樹(shù)品種一芽一二葉。

        纖維素酶(EC3.2.1.4,20000 U/mL):諾維信生物技術(shù)有限公司 (中國(guó)上海); 木瓜蛋白酶(EC 3.4.22.2,50000 U/g):廣西南寧東恒華道生物科技有限公司;單寧酶(EC 3.1.1.20,500 U/g):江西百盈生物科技有限公司。兒茶素標(biāo)品:上海源葉生物科技有限公司;茶黃素標(biāo)品:Sigma-Aldrich 有限公司;乙腈(色譜純)、蒽酮、乙醇等化學(xué)分析試劑:國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        YF-6CWD-6 型紅茶萎凋槽: 安溪縣永鋒機(jī)械有限公司;6CSW-100 搖青機(jī)、6CR-35 茶葉揉捻機(jī):浙江上洋機(jī)械有限公司;干燥箱:上海印溪儀器儀表有限公司。 ME4001 型電子天平: 梅特勒-托利儀器有限公司;DK-S26 型電熱恒溫水浴鍋、HG-9146A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;1525 型高效液相色譜儀:美國(guó) Waters 公 司 ;5424R 型 高 速 離 心 機(jī) : 德 國(guó)Eppendorf 公司;UV-2102PC 型紫外分光光度計(jì):上海尤尼柯儀器有限公司;LRH-70 型生化培養(yǎng)箱:上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

        1.3 加工實(shí)驗(yàn)方法

        紅茶加工技術(shù)路線(xiàn)為萎凋、揉捻、發(fā)酵、干燥、提香,在揉捻過(guò)程中加入食品酶制劑。

        加工流程為將當(dāng)日采摘的夏秋鮮葉均勻攤放于萎凋槽中,攤?cè)~厚度15 cm,環(huán)境溫度30 ℃、環(huán)境濕度80%~86%下自然萎凋21 h,獲得適宜揉捻的萎凋葉。 取等量2 kg 萎凋葉進(jìn)行揉捻和發(fā)酵試驗(yàn), 設(shè)置揉捻和發(fā)酵實(shí)驗(yàn)條件為環(huán)境溫度25 ℃、環(huán)境濕度88%,輕壓揉捻(20 min)→中壓揉捻(60 min)→發(fā)酵(28 ℃,8 h)。 酶制劑添加量實(shí)驗(yàn)安排見(jiàn)表1。 干燥和提香參數(shù)根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn),確定干燥參數(shù)先 110 ℃、55 min, 再 70 ℃、120 min,提香參數(shù) 120 ℃、35 min。

        表1 外源酶應(yīng)用實(shí)驗(yàn)安排Table 1 Test design of the addition of exogenous enzymes

        1.4 紅茶品質(zhì)分析方法

        對(duì)紅茶樣品進(jìn)行品質(zhì)成分分析, 主要分析水浸出物、茶多酚、可溶性糖、咖啡堿、兒茶素、茶黃素、茶氨酸的含量,以此探討外源酶對(duì)紅茶內(nèi)質(zhì)成分的影響。 含水率的測(cè)定參照GB/T 8304—2013《茶 水分測(cè)定》; 水浸出物的測(cè)定參照 GB/T 8305—2013《茶 水浸出物含量測(cè)定》;咖啡堿含量的測(cè)定參照GB/T 8312—2013《茶 咖啡堿測(cè)定》;茶多酚和兒茶素含量測(cè)定參照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類(lèi)含量的檢測(cè)方法》;茶氨酸含量測(cè)定參照GB/T 23193—2017《茶葉中茶氨酸的測(cè)定 高效液相色譜法》;茶黃素含量測(cè)定參照GB/T 30483—2013 《茶葉中茶黃素的測(cè)定高效液相色譜法》; 可溶性糖測(cè)定采用蒽酮-硫酸比色法[14]。

        1.5 數(shù)據(jù)分析

        數(shù)據(jù)處理和圖表繪制采用WPS OFFICE EXCEL 2007。 每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,最終數(shù)據(jù)取平均值表示。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 水浸出物含量

        從圖1 可以看出, 加酶樣品的水浸出物含量均高于對(duì)照樣, 說(shuō)明加酶能夠增加茶葉的水浸出物含量, 以及酶將茶葉中水不溶性組分經(jīng)酶解作用實(shí)現(xiàn)部分可溶。 對(duì)樣品進(jìn)行排序:對(duì)照<單寧酶01#<單寧酶02#<單寧酶03#<蛋白酶03#<蛋白酶01#<蛋白酶+單寧酶<纖維素酶01#<蛋白酶02#<纖維素酶02#<纖維素酶03#<蛋白酶+纖維酶<三種酶混合<單寧酶+纖維酶。從排序結(jié)果來(lái)看,就三種酶單獨(dú)使用而言, 纖維素酶對(duì)于紅茶水浸出物含量的增加效果最好,其次是蛋白酶,最后是單寧酶,這與三種酶的自身特性和底物含量有關(guān);就兩兩組合酶來(lái)說(shuō),單寧酶+纖維素酶最好,其次是蛋白酶+纖維素酶,最后是蛋白酶+單寧酶,且所測(cè)值高于單酶,說(shuō)明雙酶間有協(xié)同增效作用。當(dāng)三種酶同時(shí)應(yīng)用時(shí),其效果并未特別突出,與蛋白酶+纖維素酶、單寧酶+纖維素酶、纖維素03#相當(dāng)。

        圖1 紅茶樣水浸出物含量Fig.1 Water extract content of black tea samples

        2.2 可溶性糖含量

        從圖2 可知, 加酶可以顯著增加紅茶中可溶性糖含量, 增加幅度最低者蛋白酶02# 增加了59%, 增加幅度最高者纖維素酶 01# 增加了193%,這一結(jié)果從內(nèi)質(zhì)上支撐了紅茶滋味甜度的提高。對(duì)比加酶樣品,纖維素酶參與的樣品可溶性糖含量高,其次是單寧酶,最后是蛋白酶。 從雙酶樣品結(jié)果可知蛋白酶和單寧酶組合具有協(xié)同增效作用,而與纖維素酶組合呈降效作用。

        2.3 多酚總量

        多酚是茶葉中非常重要的品質(zhì)成分, 是多酚氧化酶作用的底物, 其氧化產(chǎn)物是紅茶中重要的內(nèi)質(zhì)成分茶紅素、茶黃素等。 如圖2 所示,實(shí)驗(yàn)樣品的多酚總量主要介于11.12~17.46 g/100 g。與對(duì)照樣相比,除單寧酶01# 外,其余加酶樣品中多酚總量都高于對(duì)照樣。結(jié)合雙酶結(jié)果推斷,就單酶使用而言蛋白酶對(duì)于增加多酚總量作用最大, 就雙酶使用而言蛋白酶和纖維素酶具有協(xié)同增效作用。

        2.4 咖啡堿含量

        如圖2, 加酶后樣品中咖啡堿含量與對(duì)照相當(dāng),分布在4.64~5.70 g/100 g 之間,說(shuō)明加酶對(duì)紅茶中咖啡堿的含量影響不大, 進(jìn)一步推測(cè)茶葉中咖啡堿的存在受水不溶蛋白和纖維素等大分子影響較小, 或是與蛋白或纖維素之間結(jié)合態(tài)少的緣故。

        圖2 紅茶樣茶多酚、可溶性糖和咖啡堿含量Fig.2 Content of tea polyphenols, suluble sugar and caffeine in black tea samples

        2.5 茶氨酸含量

        紅茶樣品中的茶氨酸含量分布在0.35~0.60 g/100 g 之間,加酶后樣品中纖維素酶01# 與對(duì)照相當(dāng),其余樣品茶氨酸含量均低于對(duì)照,且酶用量最大者降幅也最大,見(jiàn)圖3。 可能是因?yàn)槊附庾饔么蚱屏瞬枞~細(xì)胞系統(tǒng)中物質(zhì)間固有的平衡, 使得L-茶氨酸暴露或游離出來(lái),光照下引起不穩(wěn)定[15]。

        2.6 茶黃素含量

        茶黃素由多酚類(lèi)及其衍生物氧化縮合而來(lái),主要是由兒茶素中的 (-) 表沒(méi)食子兒茶素 (LEGC) 與 (-) 表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯 (LEGCG) 縮合而成,TF-3-G (茶黃素-3-沒(méi)食子酸酯)、TF-3'-G(茶黃素-3'-沒(méi)食子酸酯)、TFDG(茶黃素-3,3-雙沒(méi)食子酸酯)和TF(茶黃素)是常見(jiàn)的可檢測(cè)的茶黃素單體。 紅茶中茶黃素類(lèi)的含量一般為0.3%~1.5%,對(duì)紅茶品質(zhì)起著決定性作用。所有實(shí)驗(yàn)樣中(圖4),以單寧酶+纖維素酶樣品的茶黃素總量最高為1.54 g/100 g,以單寧酶01# 最低0.53 g/100 g。 實(shí)驗(yàn)樣品的茶黃素含量排序?yàn)椋簡(jiǎn)螌幟?01#<單寧酶 02#<蛋白酶 02#<蛋白酶01#<單寧酶03#<對(duì)照<蛋白酶+單寧酶<蛋白酶03#<三種酶混合<纖維素酶03#<纖維素酶01#<纖維素酶02#<蛋白酶+纖維酶<單寧酶+纖維酶。三種酶中纖維素酶對(duì)茶黃素具有增效作用, 單寧酶作用后茶黃素含量比對(duì)照低。 無(wú)論是蛋白酶還是單寧酶與纖維素組合,都表現(xiàn)出增效作用。

        2.7 兒茶素含量

        兒茶素是茶鮮葉中的特征性成分, 紅茶發(fā)酵工序?qū)翰杷赝ㄟ^(guò)非微生物作用的聚合、氧化、異構(gòu)化等反應(yīng)轉(zhuǎn)化為茶黃素或茶紅素等。 圖5,加酶后兒茶素總量都提高了60%以上, 加酶樣品中兒茶素總量最高者為單寧酶01# 和單寧酶+纖維素酶、最低者為三種酶混合樣品。 就單酶而言,從提高程度上排序?yàn)槔w維素酶>蛋白酶>單寧酶。 無(wú)論蛋白酶還是單寧酶與纖維素酶組合使用, 提高幅度均不及纖維素酶或蛋白酶單獨(dú)使用。

        圖3 紅茶樣茶氨酸含量Fig. 3 Content of theanine in black tea samples

        圖4 紅茶樣中茶黃素含量Fig.4 Content of theaflavins in black tea samples

        3 討論

        縱觀上述紅茶的水浸出物、 茶多酚、 可溶性糖、咖啡堿、兒茶素、茶黃素、茶氨酸含量7 個(gè)主要品質(zhì)指標(biāo)的變化,結(jié)合表2 木瓜蛋白酶、纖維素酶和單寧酶的作用機(jī)理和應(yīng)用效果分析:(1)單寧酶通過(guò)水解多酚類(lèi)化合物中酯鍵和縮酚酸鍵實(shí)現(xiàn)對(duì)茶葉中茶多酚、兒茶素總量及單體、茶黃素總量及單體的動(dòng)態(tài)調(diào)控。 研究認(rèn)為單寧酶能夠增加茶梗提取液中兒茶素的總量[16],且公認(rèn)單寧酶能夠轉(zhuǎn)溶“茶乳酪”(多酚類(lèi)、咖啡堿、蛋白質(zhì)等物質(zhì)通過(guò)分子間氫鍵與疏水作用絡(luò)合而成),即通過(guò)水解切斷兒茶素復(fù)合物中的酯鍵, 解離出的沒(méi)食子酸又能與茶紅素、茶黃素競(jìng)爭(zhēng)咖啡堿,形成分子量較小的水溶物,從而降低茶湯渾濁度[17],F(xiàn)UKUDA 等[18]研究也認(rèn)為單寧酶處理綠茶提取物能夠提高非聚合型兒茶素類(lèi)濃度。綜合分析,認(rèn)為在茶葉加工中使用單寧酶一方面可降解兒茶素復(fù)合體 (天然結(jié)合態(tài)茶多酚,加工中形成的茶乳酪等),另一方面對(duì)于兒茶素縮合產(chǎn)物的生成亦有一定影響。 夏秋鮮葉中因多酚、氨基酸等滋味物質(zhì)比例不協(xié)調(diào),常出現(xiàn)苦澀味, 而單寧酶通過(guò)水解作用可動(dòng)態(tài)調(diào)控多酚類(lèi)(茶多酚、兒茶素、茶黃素)的轉(zhuǎn)化,進(jìn)而改變呈味物質(zhì)的比例[19]。 (2)蛋白酶主要是對(duì)茶葉中的蛋白質(zhì)進(jìn)行水解作用, 茶葉中蛋白質(zhì)含量一般在20%左右且多是水不溶蛋白, 蛋白酶對(duì)茶葉蛋白進(jìn)行水解,產(chǎn)生肽段和部分氨基酸,增加了紅茶的水浸出物含量,同時(shí)釋放了多酚-蛋白復(fù)合物中的多酚類(lèi)物質(zhì)[20],進(jìn)而增加了紅茶中多酚類(lèi)物質(zhì)的含量,前人研究也發(fā)現(xiàn)在紅碎茶加工、紅茶發(fā)酵中添加蛋白酶, 均能夠增加茶黃素和氨基酸的含量,且此時(shí)多酚氧化酶活性可提高一倍,有效縮短發(fā)酵時(shí)間[21-23]。同時(shí)蛋白酶水解產(chǎn)生的肽段及氨基酸類(lèi)具有呈味作用[24],從而能夠改變紅茶的呈味物質(zhì)組成及比例,最終影響紅茶茶湯的滋味。 (3)纖維素酶能夠水解茶葉細(xì)胞壁物質(zhì),更快、更多的釋放細(xì)胞質(zhì), 這為茶葉中固有的多酚氧化酶提供了更多的底物和酶促機(jī)會(huì), 因此表現(xiàn)出添加纖維素酶的紅茶的多項(xiàng)品質(zhì)指標(biāo)都有增高現(xiàn)象。

        圖5 紅茶樣中兒茶素含量Fig.5 Content of catechins in black tea samples

        表2 外源酶在茶葉加工中的作用機(jī)理[25]Table 2 Mechanism of exogenous enzymes in tea processing[25]

        總體而言, 添加蛋白酶對(duì)于紅茶主要內(nèi)質(zhì)成分的增加具有較好的作用, 因此蛋白酶可優(yōu)選為紅茶加工用外源酶。纖維素酶,對(duì)于紅茶內(nèi)質(zhì)也有增加作用, 但是鑒于纖維素酶對(duì)細(xì)胞壁的水解作用,實(shí)驗(yàn)中肉眼可見(jiàn)易出現(xiàn)葉張不完整、外形和葉底不勻、茶湯有葉渣等現(xiàn)象,這對(duì)纖維素酶的實(shí)際應(yīng)用有所影響。

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