張富娟，陳鐵軍，于麗萍

(本溪市中心醫(yī)院，遼寧 本溪 117000)

非小細胞肺癌約占肺癌總數(shù)的80%，具有發(fā)病率高、預后差的特點[1].手術、放化療是目前臨床治療非小細胞肺癌的主要手段，因多數(shù)患者確診時已發(fā)展至中晚期，失去了手術機會，僅能接受放化療治療，但傳統(tǒng)化療的5 a生存率低于20%[2].近年來，隨著生物靶向治療技術的快速發(fā)展，為中晚期非小細胞肺癌患者帶來新的希望[3].厄洛替尼作為表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine kinase inhibitors，TKI)的代表藥物，可有效提高非小細胞肺癌患者預后水平[4].臨床觀察發(fā)現(xiàn)，厄洛替尼一線治療無進展生存期(PFS)明顯優(yōu)于化療[5].但治療1 a后多數(shù)患者會出現(xiàn)厄洛替尼耐藥，是肺癌患者死亡的主要原因[6]，因此，探討厄洛替尼耐藥機制具有重要意義.

miR-21位于17q23染色體上，是潛在的非小細胞癌分子標志物，對腫瘤細胞具有促生長和抗凋亡作用[7].有研究[8-10]發(fā)現(xiàn)：在多種耐藥腫瘤細胞中存在miR-21表達上調(diào)，包括miR-21過表達可誘發(fā)胃癌細胞對阿帕替尼的耐藥，介導胰腺癌對吉西他濱的耐藥，介導膀胱癌細胞對阿霉素的耐藥.而miR-21與非小細胞肺癌厄洛替尼耐藥的關系有待研究證實.本研究選用了EGFR敏感型肺癌細胞株PC-9，在體外誘導出厄洛替尼獲得性耐藥株細胞模型PC-9/ER，并通過轉(zhuǎn)染siRNA下調(diào)miR-21的表達，旨在探討miR-21在非小細胞肺癌厄洛替尼獲得性耐藥中的作用.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肺腺癌PC-9細胞(南京科佰生物科技有限公司)；使用1～5 μmol/L的厄洛替尼誘導PC-9細胞8個月，再以0.1 μmol/L的厄洛替尼連續(xù)培養(yǎng)得到獲得性耐藥細胞株PC-9/ER.胎牛血清、DMEM細胞培養(yǎng)基(蘇州艾萊薩生物科技有限公司)；CCK-8、Trizol試劑(上海康朗生物科技有限公司)；鼠抗人miR-21單克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體、HRP標記的山羊抗鼠IgG(上海默悉生物科技有限公司)；miR-21單基因套裝siRNA(上海吉瑪制藥技術有限公司).

1.2 方 法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及CCK-8檢測

1.2.2 實時定量PCR檢測

應用Trizol法提取各細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA.miR-21、GAPDH引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司設計合成.miR-21上游5′-ATGG GTGCTCG TACTGCTG-3′，下游5′-ACTCGATCGG AAACTCTGACAG-3′；內(nèi)參GAPDH上游5′-TTCC GCTCCGAGACACGAGCG-3′，下游5′-GGCGGTCGA GTGGTACCTACTAC-3′.反應條件：95 ℃ 40 s，95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，延伸72 ℃ 30 s.擴增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，計算miR-21的相對表達量.

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染及對PC-9/ER耐藥性的影響

取PC-9/ER細胞，使用陽離子脂質(zhì)體法進行細胞轉(zhuǎn)染，分為陰性對照組、siRNA-1組、siRNA-2組、siRNA-3組.轉(zhuǎn)染前按6×105個/孔的密度將細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至貼壁生長后，按siRNA說明書操作.使用riboFECTCP轉(zhuǎn)染試劑稀釋各組儲存液，加入FECTTM CP轉(zhuǎn)染試劑，室溫下靜置20 min，加入細胞培養(yǎng)液中，常規(guī)培養(yǎng)24 h，通過實時定量PCR檢測各轉(zhuǎn)染組細胞miR-21表達量.選取表達量最低組的siRNA為基因敲減工具，使用終濃度10-2、10-1、100、101、102的厄洛替尼處理PC-9/ER細胞48 h后，應用CCK-8檢測細胞生存分數(shù).

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度厄洛替尼處理后PC-9與PC-9/EP的生存分數(shù)

隨著厄洛替尼終濃度的增加，PC-9細胞和PC-9/ER細胞的生存分數(shù)均出現(xiàn)不同程度的下降，其中，厄洛替尼終濃度10-2、10-1、100、101、102的PC-9/ER細胞生存分數(shù)明顯高于PC-9細胞，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01).計算得到PC-9/ER細胞的IC50值為(7.74±1.49)μmol/L，明顯高于PC-9細胞的(0.11±0.03)μmol/L，差異具有統(tǒng)計學意義(t=21.493，P=0.001)；PC-9/ER細胞的耐藥指數(shù)為69.93±18.40，說明厄洛替尼耐藥細胞株PC-9/ER構(gòu)建成功，能夠用于后續(xù)實驗.見表1.

2.2 miR-21在PC-9與PC-9/EP細胞中的表達水平

由于厄洛替尼對PC-9細胞的IC50均值為0.11 μmol/L，因此，本研究選用質(zhì)量濃度為0.1 μmol/L的厄洛替尼處理PC-9、PC-9/ER細胞48 h，檢測miR-21表達量，結(jié)果顯示：PC-9/ER細胞的miR-21表達量明顯高于PC-9細胞，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01).為進一步分析miR-21表達與厄洛替尼劑量的關系，本研究用0.1、0.2、0.3 μmol/L的厄洛替尼處理PC-9、PC-9/ER細胞，結(jié)果顯示：隨著厄洛替尼濃度的增加，PC-9/ER細胞的miR-21表達量顯著提高，而PC-9細胞的miR-21表達無明顯變化.見表2.

2.3 不同敲減工具對PC-9/ER細胞中miR-21表達的影響

為篩選下調(diào)PC-9/ER細胞中miR-21表達的基因敲減工具，轉(zhuǎn)染24 h后通過實時定量PCR檢測各轉(zhuǎn)染組PC-9/ER細胞miR-21的表達量，結(jié)果顯示：與陰性對照組比較，siRNA-1組、siRNA-2組、siRNA-3組的miR-21表達量明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；其中siRNA-1組miR-21表達量明顯低于siRNA-2組、siRNA-3組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05).因此，選用siRNA-1基因敲減工具用于后續(xù)實驗.見表3.

2.4 下調(diào)miR-21表達對PC-9/ER細胞厄洛替尼耐藥性的影響

使用終濃度10-2、10-1、100、101、102的厄洛替尼處理PC-9/ER細胞48 h后，siRNA-1組PC-9/ER細胞的細胞生存分數(shù)明顯低于陰性對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01).見表4.

表1 不同濃度厄洛替尼處理后PC-9與PC-9/ER細胞的生存分數(shù)Tab.1 Survival scores of PC-9 and PC-9/ER cells treated with erlotinib at different concentrations

表2 miR-21在PC-9與PC-9/ER細胞中的表達水平Tab.2 miR-21 expression levels in PC-9 and PC-9/ER cells

表3 各組PC-9/ER細胞中miR-21表達量Tab.3 miR-21 expression in PC-9/ER cells of each group

表4 兩組PC-9/ER細胞的生存分數(shù)Tab.4 PC-9/ER cell survival scores of the two groups

3 討 論

miR-21作為一種致癌miRNA在肺癌、胰腺癌、直腸癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[11-12].相關研究[13]顯示：miR-21在癌組織中表達水平明顯高于癌旁組織，且高表達提高了非小細胞肺癌患者術后復發(fā)、轉(zhuǎn)移的風險，不良預后發(fā)生率高.近年來研究[14-15]發(fā)現(xiàn)：EGFR-TKI靶向治療肺癌耐藥性的出現(xiàn)與miRNA異常表達有關，使用EGFR-TKI能夠抑制miR-21的表達，提示miR-21可能調(diào)控EGFR信號通路.因此，推測致癌基因miR-21可能參與了EGFR-TKI藥物代謝及耐藥性的發(fā)生.厄洛替尼是一種低分子EGFR-TKI，為晚期或轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌患者帶來了新希望，并逐漸得到臨床認可.EGFR-TKI初治患者在治療起始多數(shù)能有效抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲，緩解病情，但隨著治療時間的延長，發(fā)展為獲得性耐藥的比例很高，是肺癌患者死亡的主要原因之一.有研究[16]對EGFR-TKI的耐藥機制進行了探討，獲得了MCT酶抑制劑、EMT抑制劑等多種活性成分，但研究多停留在動物實驗和體外細胞實驗層次，并未應用于臨床治療.本研究在已有研究報道的基礎上，探討非小細胞肺癌細胞對厄洛替尼的耐藥機制，旨在為研發(fā)逆轉(zhuǎn)厄洛替尼耐藥的靶向治療方案提供理論依據(jù).

本研究選用了EGFR敏感型肺癌細胞株PC-9，并在體外誘導出了厄洛替尼獲得性耐藥株細胞模型PC-9/ER，通過實時定量PCR檢測顯示，PC-9/ER細胞miR-21表達水平較PC-9細胞明顯提高.為進一步證實miR-21在PC-9細胞厄洛替尼獲得性耐藥中的作用，本研究通過siRNA轉(zhuǎn)染技術下調(diào)了miR-21在PC-9/ER細胞中的表達，結(jié)果顯示：miR-21表達下調(diào)明顯改善了PC-9/ER細胞對厄洛替尼的耐藥性.相關研究[17-18]顯示：非小細胞癌細胞中過表達miR-21可明顯激活Akt信號通路，促進腫瘤細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，而出現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的非小細胞肺癌被認為是厄洛替尼獲得性耐藥的主要原因之一.亦有研究[19]顯示：miR-21在卵巢癌中通過活化PI3K-Akt信號通路介導對鉑類化療藥物的耐藥.在下一步的研究中，將通過基因芯片技術比較PC-9細胞與PC-9/ER細胞的表達，發(fā)現(xiàn)信號蛋白的表達差異，進一步探討厄洛替尼獲得性耐藥的分子機制.