陶長城

河南省信陽市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南信陽464000

近年來，河南省很多地區(qū)布魯氏桿菌病感染率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢(shì)，2016年達(dá)4 000 多例。為了防控布魯氏桿菌病傳播，2017年河南省動(dòng)物強(qiáng)制免疫實(shí)施“兩進(jìn)兩退”，把布魯氏桿菌作為牛、羊必免的疫病之一開始免疫接種。為了摸清布魯氏桿菌病在信陽地區(qū)的感染情況和危害程度，制定科學(xué)的防控措施提供技術(shù)支持，2016-2017年間，筆者在信陽七縣三區(qū)范圍內(nèi)對(duì)牛、羊和豬開展布魯氏桿菌病的流行病學(xué)調(diào)查和采樣后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 流行病學(xué)調(diào)查

2016-2017年，對(duì)信陽市七縣三區(qū)的年存欄50頭以上的養(yǎng)牛場(chǎng)94 個(gè)、年存欄100 頭以上的羊場(chǎng)63 個(gè)、5 個(gè)規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)進(jìn)行布魯氏桿菌病的流行病學(xué)調(diào)查，20 個(gè)牛場(chǎng)采集血樣，每個(gè)牛場(chǎng)隨機(jī)抽取5份血樣，還抽取3 個(gè)牛組織樣（來自有流產(chǎn)發(fā)生的2個(gè)牛場(chǎng)）；30 個(gè)羊場(chǎng)采集血樣，每個(gè)羊場(chǎng)隨機(jī)抽取10 份血樣，在有流產(chǎn)發(fā)生的羊場(chǎng)采集18 例組織樣；豬場(chǎng)采樣5 個(gè)場(chǎng)，每個(gè)場(chǎng)隨機(jī)抽取血樣20 份。

1.2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

1）病原學(xué)檢測(cè)：采集流產(chǎn)胎兒或胎盤21 例，直接涂片鏡檢。其中牛3 例，羊18 例，牛的其中1 例采集地是浉河區(qū)，另2 例來自息縣，羊的18 例分布在各個(gè)縣區(qū)。

2）血清學(xué)檢測(cè)：初檢使用國標(biāo)（GB/T18646-2002）虎紅平板凝集試驗(yàn)，復(fù)檢使用國標(biāo)（GB/T18646-2002）試管凝集試驗(yàn)。

①材料與準(zhǔn)備：抗原、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清都是購自青島動(dòng)物流調(diào)所，60 cm×60 cm 的干凈玻板3 塊（玻板上劃成4 cm×4 cm 的方格），吸管（1 滴0.03 mL），牙簽，一次性手套、口罩等防護(hù)用具。

②操作方法：在干凈的玻板方格中加注陰性血清、陽性血清、受檢血清，再在血清旁加1 滴抗原，用牙簽混勻。

③判斷：在陰性對(duì)照、陽性對(duì)照成立的情況下，對(duì)被檢血清進(jìn)行判定，受檢血清4 min 內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見凝集現(xiàn)象判為陽性，無凝集現(xiàn)象成均勻粉紅色者判為陰性。

3）虎紅平板凝集試驗(yàn)。虎紅平板凝集試驗(yàn)陽性的受檢血清樣品帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步做布病的試管凝集試驗(yàn)。

①材料與準(zhǔn)備：0.5%石碳酸、10%鹽溶液稀釋液，抗原、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清都是購自青島動(dòng)物流調(diào)所，凝集試管、試管架，吸管，恒溫培養(yǎng)箱，一次性手套、口罩等防護(hù)用具。

②以羊、豬為例稀釋受檢血清：第1 試管加入1.15 mL 的稀釋液，第2～4 試管各加入0.5 mL 稀釋液，然后用1 mL 吸管吸取被檢血清0.1 mL 加入第1 試管內(nèi)混勻（混勻方法：將試管內(nèi)混合液吸入吸管，再沿試管壁徐徐吹入試管中，如此吸入吹出3～4次充分混勻），用該吸管吸入0.25 mL 混合液棄去。再從第1 個(gè)試管內(nèi)吸取0.5 mL 混合液加入第2 個(gè)試管，用該吸管如前法混合均勻，再從第2 試管內(nèi)吸取0.5 mL 混合液加入第3 個(gè)試管，如此倍比稀釋至第4 試管，棄去0.5 mL 混合液，稀釋完畢后從第1～4 試管血清稀釋度依次為1∶12.5、1∶25、1∶50、1∶100。牛的血清稀釋法與上述基本一致，只是第1管加1.2 mL 稀釋液和0.05 mL 被檢血清。將0.5 mL 20 倍稀釋的抗原加入已稀釋好的血清管中并振搖均勻，羊和豬的血清稀比例釋依次是1∶25、1∶50、1∶100、1∶200，牛的血清稀釋比例依次是1∶50、1∶100、1∶200、1∶400。陰性對(duì)照、陽性對(duì)照稀釋和加抗原的方法與被檢血清相同，抗原對(duì)照：20 倍稀釋抗原液0.5 mL，再加0.5 mL 稀釋液觀察抗原是否有自凝現(xiàn)象。放置在37～40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h 取出檢查并記錄結(jié)果。

③判定：參照比濁管判定凝集度，比濁管的制備見表1。

表1 比濁管的制備

牛的1∶100 血清稀釋，豬、羊的1∶50 血清稀釋出現(xiàn)++凝集時(shí)受檢血清判為陽性；牛的1∶50血清稀釋，豬、羊的1∶25 血清稀釋出現(xiàn)++凝集時(shí)受檢血清判為可疑，可疑的家畜經(jīng)3～4 周后重檢如果仍為可疑，牛、羊判為陽性，豬重檢可疑，可根據(jù)臨床癥狀和同場(chǎng)內(nèi)有沒有大量陽性病例判定，如沒有則可判為陰性。

2 結(jié)果與分析

采集20 個(gè)養(yǎng)牛場(chǎng)100 份血清樣品，只有8 份陽性樣品，陽性率8%，陽性場(chǎng)有2 個(gè)，陽性率10%。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查和檢測(cè)結(jié)果表明信陽地區(qū)養(yǎng)牛場(chǎng)有布魯氏桿菌感染：采集20 個(gè)養(yǎng)牛場(chǎng)100 份血樣，只有8 份陽性，陽性率8%，陽性場(chǎng)有2 個(gè)，陽性率10%。養(yǎng)羊場(chǎng)病原學(xué)沒有發(fā)現(xiàn)陽性，血清學(xué)檢測(cè)30 個(gè)場(chǎng)，陽性場(chǎng)數(shù)21 個(gè)，陽性率70%，樣品陽性數(shù)126，樣品陽性率42%。養(yǎng)豬場(chǎng)病原學(xué)沒有發(fā)現(xiàn)陽性，血清學(xué)5 個(gè)場(chǎng)100 份樣，只有1 個(gè)陽性，陽性率1%。血清學(xué)檢測(cè)陽性是疫苗免疫的結(jié)果。

3 討 論

1）養(yǎng)牛場(chǎng)的2 個(gè)陽性場(chǎng)，一個(gè)是肉牛場(chǎng)，一個(gè)是奶牛場(chǎng)，其中奶牛場(chǎng)較為嚴(yán)重，5 份樣品2 次檢驗(yàn)全是陽性，后來市、縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心的工作人員對(duì)該場(chǎng)進(jìn)行普檢，檢出染疫牛20 多頭，全部撲殺。另一個(gè)肉牛場(chǎng)普檢查出2 頭陽性牛，也給予撲殺。

2）這2年國家要求對(duì)牛、羊布魯氏桿菌病實(shí)施強(qiáng)制免疫，從流行病學(xué)調(diào)查來看，養(yǎng)牛場(chǎng)執(zhí)行并不理想，養(yǎng)羊場(chǎng)執(zhí)行較好，但從免疫效果來看并不理想。而從免疫學(xué)和生態(tài)學(xué)上看，對(duì)牛羊?qū)嵤?qiáng)制免疫還要進(jìn)一步調(diào)研。

3）養(yǎng)羊場(chǎng)也經(jīng)常見到流產(chǎn)，但大部分是機(jī)械性流產(chǎn)、營養(yǎng)性流產(chǎn)、中毒性流產(chǎn)，也有疾病性流產(chǎn)，不過因布魯氏桿菌引起的流產(chǎn)很少見，可能有2 個(gè)方面的原因：一是信陽地區(qū)養(yǎng)牛的數(shù)量和規(guī)模都較小，二是與信陽人的生活習(xí)慣有關(guān)，信陽人大部分都比較喜潔凈，養(yǎng)殖場(chǎng)也很注重衛(wèi)生和消毒。