高汝勇

（衡水學(xué)院生命科學(xué)系 河北 衡水053000）

果蠅是經(jīng)典遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)的模式生物。果蠅3齡幼蟲是觀察唾腺染色體的優(yōu)選材料[1]，果蠅唾腺染色體常染色質(zhì)區(qū)的核蛋白纖維在分裂間期不斷復(fù)制，但復(fù)制產(chǎn)物卻不分開，結(jié)果成千上萬條染色質(zhì)纖維平行排列成一個(gè)長(zhǎng)為2 mm、寬為5 um的寬大帶狀物，因此成為多線染色體[2]。唾腺染色體上的橫紋具有特異性，染色體上發(fā)生的缺失、重復(fù)、易位等結(jié)構(gòu)變異很容易在光學(xué)顯微鏡下通過橫紋的位置和數(shù)目來判斷。另外果蠅唾腺染色體也是觀察染色體形態(tài)特征，研究其化學(xué)組成、基因表達(dá)調(diào)控，以及進(jìn)行各類神經(jīng)疾病研究等的很好材料[3]。果蠅唾腺染色體觀察實(shí)驗(yàn)是遺傳學(xué)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)之一，該試驗(yàn)操作性很強(qiáng)，在學(xué)生制片過程中染色體往往聚成團(tuán)，降低實(shí)驗(yàn)效果。本試驗(yàn)研究唾腺剖取前的一些試驗(yàn)步驟，旨在提高唾腺染色體的伸展效果，提高試驗(yàn)的成功率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和用品。果蠅，改良品紅、0.4%NaCl、0.75%NaCl、玉米粉、瓊脂、酵母粉、白糖、丙酸。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備。玉米粉15 g、瓊脂1.5 g、酵母1.4 g、水150 ml、白糖27 g、丙酸1.5 ml，制備5瓶培養(yǎng)基。

1.2.2 幼蟲培養(yǎng)。在250 ml的培養(yǎng)基中接種10對(duì)左右成蟲。大量幼蟲出現(xiàn)后，在培養(yǎng)基表面撒少許酵母粉，把幼蟲放在15℃～18℃的恒溫箱中培養(yǎng)。

1.2.3 唾腺染色體標(biāo)本制備。在大量3齡幼蟲出現(xiàn)后，把幼蟲培養(yǎng)基放置在3℃～5℃的冰箱中，分別低溫處理12 h、24 h、36 h。挑選3齡幼蟲中已爬上瓶壁、行動(dòng)遲緩、長(zhǎng)約5 mm、半透明或者有些發(fā)黃但未化蛹的肥大幼蟲。剖取腺體、解離、水洗、改良品紅染色、壓片，顯微鏡下觀察、拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 肥大幼蟲的培養(yǎng)。按照如上配方，減少了5 g玉米粉的用量，制成的培養(yǎng)基比較松軟，發(fā)酵良好，非常適合果蠅幼蟲生長(zhǎng)。大量低齡幼蟲出現(xiàn)后向培養(yǎng)瓶中加入的酵母粉可作為幼蟲的補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)。把幼蟲放在15℃～18℃的恒溫箱中培養(yǎng)，能改變果蠅的生活周期，延長(zhǎng)幼蟲階段的時(shí)間，能使幼蟲變得肥大，唾腺也相應(yīng)增大，這樣有利于學(xué)生在解剖鏡下識(shí)別唾腺、剖取唾腺。

2.2 低溫處理效果分析

2.2.1 傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法弊端。獲得合適3齡幼蟲后，傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法都是先剖出唾腺，然后直接用鹽酸進(jìn)行解離，這種方法在后期制片時(shí)唾腺染色體不容易分散，必須費(fèi)力用橡皮頭敲擊蓋片以利于染色體分散。但是學(xué)生在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)往往不好掌握敲擊的力度和時(shí)間，力度小、時(shí)間短沒有效果；力度過大、時(shí)間過長(zhǎng)唾腺染色體又容易發(fā)生斷裂。

2.2.2 低溫處理后效果。3齡幼蟲經(jīng)過低溫處理后可以改善唾腺染色體的伸展效果。本實(shí)驗(yàn)在有大量3齡幼蟲出現(xiàn)后，把幼蟲培養(yǎng)基放置在3℃～5℃的冰箱中分別低溫處理12 h、24 h、36 h。之后按照常規(guī)方法剖取唾腺、鹽酸解離、水洗、染色、獲得制片，比較低溫處理在剖取唾腺染色體難易程度、脂肪剔除的難易程度以及染色體伸展程度上的區(qū)別，最終結(jié)果如表1。

表1低溫處理時(shí)間及其效果

根據(jù)表1我們可以看出，低溫處理12 h的3齡幼蟲最易剖取唾腺。低溫處理24 h之后，3齡幼蟲身體彈性降低，在剖取唾腺過程中身體容易斷裂，所以相比于低溫12 h的幼蟲較難剖取唾腺。低溫處理36 h的3齡幼蟲，身體已經(jīng)完全沒有了彈性，經(jīng)常一拉就斷，內(nèi)容物流出，學(xué)生往往找不到食道，更不容易找到食道前端兩側(cè)的一對(duì)唾腺。在剔除脂肪的難易程度上可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過低溫處理的幼蟲比未經(jīng)處理的幼蟲好剔除脂肪，并且隨著低溫時(shí)間的延長(zhǎng)，脂肪量越少，處理36 h的幼蟲幾乎沒有脂肪，或者有很少量的脂肪，也容易用解剖針剔除。在染色體伸展效果上，低溫處理24 h的效果最好(如圖1)，其次是12 h的(如圖2)，36 h的效果最差(如圖3)。

圖1低溫處理24 h

圖2低溫處理12 h

圖3低溫處理36 h

圖4分散良好的唾腺染色體

2.3 解剖前低滲預(yù)處理。研究對(duì)比了在0.75% NaCl中直接剝?nèi)⊥傧伲谡麴s水和0.4% NaCl分別低滲30 min、在0.75%NaCl中等滲30 min后再剝?nèi)〉膶?shí)驗(yàn)，以便區(qū)分常規(guī)直接解剖與低滲處理后解剖在拉取唾腺、剔除脂肪的難易程度上的區(qū)別。

2.3.1 蒸餾水低滲30 min。在蒸餾水中低滲30 min后的幼蟲，由于吸水明顯變大很多，同樣唾腺染色體細(xì)胞也由于吸水變大，所以在解剖過程中唾液腺腺體很容易找到，并且脂肪都是聚集在一起的，一拉便可完全剔除。

2.3.2 0.4% NaCl低滲30 min。在0.4% NaCl中低滲30 min后的幼蟲及其唾液腺腺體雖然也會(huì)吸水膨脹，但沒有在蒸餾水中膨脹的大，因此在解剖的難易程度上，相比于蒸餾水處理過的稍微遜色一些，但仍是好剖取的。在染色體伸展?fàn)顩r上，0.4%NaCl處理要比蒸餾水處理要好，伸展得更充分。

2.3.3 0.75% NaCl中等滲處理30 min再剖取唾腺和0.75%NaCl中直接剖取唾腺。在0.75% NaCl中等滲處理30 min后再剖取唾腺和在0.75%NaCl中直接剖取唾腺時(shí)，幼蟲頭部較小，不容易拉伸，唾腺也小，不容易尋找，并且脂肪分布雜亂，不容易剔除，效果較差。

3 結(jié)論與討論

多飼酵母粉和15℃～18℃條件下培養(yǎng)果蠅幼蟲，利于幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育，可增加唾腺腺體體積，利于唾腺的識(shí)別和剖取。

將3齡幼蟲置于3℃～5℃低溫下處理24 h，利于唾腺剖取、脂肪體的剝離、染色體的伸展。在解剖果蠅之前，若用低滲溶液處理，細(xì)胞會(huì)吸水膨脹變大，有利于拉取唾腺和識(shí)別腺體，并且在壓片時(shí)，染色體能更好的分散[4]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，把低溫處理24 h后的3齡幼蟲在0.4% NaCl中低滲30 min，這樣制得的染色體制片成功率明顯比常規(guī)方法高很多(圖4)。這些在剖取唾腺之前的預(yù)處理步驟會(huì)大大提高實(shí)驗(yàn)的成功率，解決常規(guī)方法中學(xué)生經(jīng)常遇到的不好剖唾腺、不易找到腺體、染色體伸展不充分、細(xì)胞重疊等問題。