張海紅，田洪蕓，王文特，任雪梅，王駿

(1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，濟(jì)南 250101;2.山東省特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，濟(jì)南 250101)

0 引 言

左旋肉堿（L-carnitine）又稱肉毒堿或維生素BT，是人類必須的一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其主要功能是轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪進(jìn)入線粒體，促進(jìn)脂肪酸氧化，為機(jī)體提供能量[1-2]。人體的左旋肉堿來(lái)源：一是通過(guò)肝臟和腎臟進(jìn)行內(nèi)源性合成，二是從膳食攝?。ㄖ饕莿?dòng)物性食品）[3]。人體左旋肉堿缺乏將影響脂肪酸的代謝，從而導(dǎo)致能量合成不足，出現(xiàn)易疲勞、肌肉無(wú)力、心慌等癥狀，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)代謝紊亂，昏迷甚至死亡。隨著人們對(duì)左旋肉堿營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的關(guān)注及認(rèn)可，它已經(jīng)被越來(lái)越多地用于減肥食品、嬰幼兒食品、飲料、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、臨床等方面[4]。嬰幼兒機(jī)體尚未發(fā)育成熟，自身不能合成左旋肉堿或合成量不能滿足機(jī)體需要，所以準(zhǔn)確定量嬰幼兒配方食品中的左旋肉堿含量，對(duì)保障嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)攝入是至關(guān)重要的[5]。GB 10765-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰兒配方食品》、GB 10767-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)較大嬰兒和幼兒配方食品》、GB 29922-2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品通則》和GB 25596-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品通則》均將左旋肉堿列為可選擇性添加的營(yíng)養(yǎng)成分，并規(guī)定了最小添加量。

目前左旋肉堿的檢測(cè)主要采用分光光度法、高效液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、化學(xué)法、毛細(xì)管電泳色譜法和免疫法等[6-11]。我國(guó)現(xiàn)行相關(guān)檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)為GB 29989-2013《嬰幼兒食品和乳品中左旋肉堿的測(cè)定》[12]，屬于分光光度法，適用范圍為嬰幼兒食品和乳品。在日常檢驗(yàn)工作中發(fā)現(xiàn)，對(duì)于氨基酸配方和蛋白質(zhì)水解配方特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品，同時(shí)配料中添加了麥芽糊精和預(yù)糊化淀粉的產(chǎn)品，存在以下缺點(diǎn)：(1)高氯酸沉淀蛋白后樣品溶液難以過(guò)濾，過(guò)濾時(shí)間比較長(zhǎng)，影響了實(shí)驗(yàn)效率和批量化要求;(2)過(guò)濾下來(lái)的濾液不澄清，吸光度值通常大于1，不滿足分光光度比色的溶液要求，嚴(yán)重影響紫外吸收的測(cè)定，數(shù)據(jù)離散性大，加標(biāo)回收率不好。原因有：一是氨基酸和小分子量多肽是小分子，高氯酸沉淀劑不能將其沉淀下來(lái)，普通濾紙不能過(guò)濾掉，甚至?xí)氯麨V紙孔，導(dǎo)致過(guò)濾速度慢和濾液渾濁；二是樣品配料添加的麥芽糊精和預(yù)糊化淀粉的冷水溶脹，黏度增大，也會(huì)使樣品處理液難以過(guò)濾[1-14]。

本研究在GB 29989-2013標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，利用Taka淀粉酶來(lái)水解樣品中麥芽糊精和預(yù)糊化淀粉，對(duì)前處理方法加以改進(jìn)，克服以上缺點(diǎn)，建立了氨基酸配方和蛋白質(zhì)水解配方特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中左旋肉堿的檢測(cè)方法，并對(duì)圣元優(yōu)博、青島瀚姆、貝因美、雅培、雀巢、紐迪希亞等6家以上企業(yè)的氨基酸配方和蛋白質(zhì)水解配方特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品或試制品進(jìn)行了測(cè)定，擬為這類特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品的質(zhì)量安全監(jiān)管和質(zhì)量控制提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)Evolution 300，美國(guó)賽默飛世爾公司；恒溫水浴鍋DZKW-S-6，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

純度≥98%左旋肉堿對(duì)照品，美國(guó)Sigma公司；分析純高氯酸，天津市鑫源化工有限公司；分析純氫氧化鈉、氫氧化鉀、乙二胺四乙酸二鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2-硝基苯甲酸、N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶(CAT)、TaKa淀粉酶，均為美國(guó)Sigma公司；乙酰輔酶A，羅氏公司。

嬰兒配方乳粉、氨基酸配方、乳蛋白深度水解和乳蛋白部分水解配方特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品均為日常工作中的檢驗(yàn)樣品，涉及6家以上國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)企業(yè)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（80μg/mL）：精確稱取20 mg于102±2℃烘箱中烘2 h的左旋肉堿（純度≥98%），用水定容至250 mL容量瓶中。此溶液可在4℃冰箱中保存1個(gè)月。

左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.50，1.00，2.00，3.00，5.00 mL于25 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻，該標(biāo)準(zhǔn)系列濃度分別為1.6、3.2、6.4、9.6、16μg/mL。現(xiàn)用現(xiàn)配。

高氯酸溶液（13%）：移取13 mL高氯酸用水稀釋至100 mL。

氫氧化鈉溶液（10 mol/L）：稱取40 g氫氧化鈉用水溶解，冷卻后稀釋至100 mL。

氫氧化鉀溶液（4.0 mol/L）：稱取22.4 g氫氧化鉀用水溶解，冷卻后稀釋至100 mL。

顯色儲(chǔ)備液：分別稱取50 mg 2-硝基苯甲酸、5.96 g N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、0.185 g乙二胺四乙酸二鈉溶于30 mL水中，用10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)p H至7.4～7.6，用水定容至50 mL。顯色儲(chǔ)備液可在4℃冰箱中保存3個(gè)月。

顯色工作液：吸取5.00 mL顯色儲(chǔ)備液用水定容至25 mL。現(xiàn)用現(xiàn)配。

乙酰輔酶A（Acetyl CoA）溶液：稱取20.0 mg乙酰輔酶A溶于2.0 mL水中?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶(CAT)溶液：吸取100μL乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶懸浮液，加入2 mL水溶解?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

TaKa淀粉酶溶液：稱取2.50 g TaKa淀粉酶溶于50 mL水中。現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品前處理

（1）試樣提取。稱取試樣5 g（精確至0.0001 g）于50 mL燒杯中，用30 mL 40℃溫水溶解并轉(zhuǎn)入100 mLl容量瓶中，準(zhǔn)確加入TaKa淀粉酶溶液1 mL，混勻，于60℃水浴水解30 min，再加入10 mL 13%高氯酸溶液，混合均勻后靜置20 min，用水定容至刻度，混勻，用定量快速濾紙過(guò)濾。

（2）測(cè)定液的制備。移取濾液20 mL，置于50 mL廣口錐形瓶中，用4 mol/L氫氧化鉀溶液調(diào)整濾液p H至12.5～13.0，置于40℃水浴60 min。取出冷卻后用高氯酸溶液調(diào)整pH至7.0～7.5。將溶液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，用水定容，混勻，于4℃冰箱中放置過(guò)夜。

將試樣處理液從冰箱中取出，放置至室溫，用一次性注射器吸取上清液，用0.45μm濾膜過(guò)濾于5 mL PE離心管中備用。

1.2.3 測(cè)定

分別吸取左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)工作液、濾膜過(guò)濾后的試樣測(cè)定液2.0 mL于1 cm比色皿中，依次加入0.8 mL顯色工作液、100μL乙酰輔酶A溶液，蓋上比色皿蓋，混合均勻，放置5 min后立即放入已用水調(diào)零的紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)中，在波長(zhǎng)為412 nm下測(cè)定吸光值A(chǔ)1并迅速加入100μL乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶溶液，迅速混合均勻，放置10 min立即后于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)中測(cè)定吸光值A(chǔ)2。以左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的吸光值A(chǔ)2與吸光值A(chǔ)1之差為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。用試樣測(cè)定液的吸光值A(chǔ)2與吸光值A(chǔ)1之差在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得試樣測(cè)定液中左旋肉堿的濃度，進(jìn)而計(jì)算樣品中左旋肉堿含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

選取一種氨基酸特殊醫(yī)學(xué)用途配方乳粉A，該樣品配料中添加了麥芽糊精(在配料表中第一位)和預(yù)糊化淀粉，按照國(guó)標(biāo)方法，樣品處理液難以過(guò)濾，濾液不澄清。

2.1.1 加酶量

稱樣5.0 g，加一定量的酶(如1%，就是5 g樣品，加0.05 g酶)，水浴溫度60℃，水浴時(shí)間30 min，水解后，加10 mL 13%高氯酸，靜置20 min，定容，搖勻，過(guò)濾，考察加酶量為0%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、5%、10%、15%、20%時(shí)樣品過(guò)濾液的透光率。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)圖1所示。

圖1 樣品溶液的透光率隨加酶量的變化

由圖1可以看出，隨加酶量的增加，樣品溶液的透光率顯著增大，并于加酶量0.5%之后趨于穩(wěn)定并稍有下降，因此確定1%為最佳加酶量。

2.1.2 水解時(shí)間

稱樣5.0 g，加酶量1%，水浴溫度60℃，水解一定時(shí)間。水解后，加10 mL 13%高氯酸，靜置20 min，定容，搖勻，過(guò)濾，考察水解時(shí)間為5、10、20、30、40、50、60 min時(shí)樣品過(guò)濾液的透光率。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)圖2所示。

圖2 樣品溶液的透光率隨水解時(shí)間的變化

由圖2可以看出，隨水解時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品溶液的透光率逐漸增大，并于10 min之后趨于穩(wěn)定。鑒于特殊醫(yī)學(xué)用途配方乳粉基質(zhì)復(fù)雜，適當(dāng)延長(zhǎng)樣品的水解時(shí)間，確定最佳水解時(shí)間為30 min。

2.1.3 水解溫度

稱樣5.0 g，加酶量1%，一定溫度下水解30 min，水解后，加10 mL 13%高氯酸，靜置20 min，定容，搖勻，過(guò)濾，測(cè)定樣品過(guò)濾液透光率。通常淀粉酶的使用溫度為45～70℃[15]，考察了水浴溫度40、50、60、70℃時(shí)樣品過(guò)濾液的透光率。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)圖3所示。

由圖3可以看出，樣品溶液的透光率先逐漸增大，后稍有下降，并且50℃以上時(shí)，樣品溶液的透光率都大于90%，因此確定最佳水解溫度為60℃。

2.1.4 沉淀劑用量

圖3 樣品溶液的透光率隨水浴溫度的變化

Taka淀粉酶水解了麥芽糊精等淀粉類物質(zhì)，同時(shí)為了避免Taka淀粉酶對(duì)后面的左旋肉堿酶反應(yīng)有影響和消除蛋白質(zhì)及其多肽鏈影響[16]，需要進(jìn)一步把樣品溶液中的Taka淀粉酶和樣品蛋白質(zhì)沉淀下來(lái)。稱樣5 g，加酶量1%，60℃水解30 min，加一定體積的13%高氯酸溶液，靜置20 min，定容至100 mL，搖勻，過(guò)濾，考察了0、2.5、5.0、7.5、10.0mL高氯酸溶液加入量的對(duì)樣品過(guò)濾溶液透光率的影響。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)圖4所示。

圖4 樣品溶液的透光率隨高氯酸溶液加入量的變化

由圖4可以看出，隨著高氯酸溶液加入量的增大，樣品過(guò)濾液的透光率逐漸增大并在5 mL之后趨于穩(wěn)定。因此10 mL 13%高氯酸溶液加入量是足夠的，與國(guó)標(biāo)方法一致。

因此，確定了最佳前處理?xiàng)l件，稱樣5 g，加酶量1%，60℃水解30 min，加10 mL 13%高氯酸溶液，混勻，靜置20 min，定容至100 mL，混勻，過(guò)濾。

2.2 線性曲線及檢出限

在波長(zhǎng)412 nm處樣品測(cè)定液反應(yīng)前后吸光度值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖5)，2 mL測(cè)定液中左旋肉堿濃度在0～16μg/mL范圍內(nèi)(相當(dāng)于5 g樣品中左旋肉堿含量0～80 mg/100g)呈良好的一次線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2為0.9998，樣品檢測(cè)限(LOD)為2mg/100g，與國(guó)標(biāo)方法一致。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

選取嬰兒配方乳粉R和氨基酸特殊醫(yī)學(xué)用途配方乳粉A，進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，并與國(guó)標(biāo)方法對(duì)比。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

可見(jiàn)，對(duì)于嬰幼兒配方乳粉R，未酶解樣品的左旋肉堿平均值為19.0 mg/100g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.78%；酶解樣品的左旋肉堿平均值為18.9 mg/100g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.69%。兩種前處理結(jié)果一致，數(shù)據(jù)分布集中，精密度好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差都符合實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制要求[17]。

圖5 左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

對(duì)于氨基酸配方特殊醫(yī)學(xué)用途配方乳粉A，未酶解樣品的左旋肉堿平均值為53.1 mg/100g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為9.56%，數(shù)據(jù)離散程度大；酶解樣品的左旋肉堿平均值為60.5 mg/100g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.40%。說(shuō)明，對(duì)于氨基酸配方特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品A，只有酶水解樣品精密度好，符合實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制要求。

2.4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

選取氨基酸特殊醫(yī)學(xué)用途配方乳粉A，在5 mg/100g、15 mg/100g和50 mg/100g 3個(gè)添加水平下進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，并與國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行對(duì)比。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

對(duì)于嬰幼兒配方乳粉R，在3個(gè)添加水平下，未酶解樣品的加標(biāo)回收率為98.0%～103.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.89%～3.30%;酶解樣品的加標(biāo)回收率為100.3%～104.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.82%～2.48%。說(shuō)明，對(duì)于嬰幼兒配方乳粉，未酶解和酶水解樣品的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差都符合實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制要求。

對(duì)于氨基酸配方特殊醫(yī)學(xué)用途配方乳粉A，在3個(gè)添加水平下，未酶解樣品的加標(biāo)回收率為81.7%～109.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為10.3%～12.7%，在5 mg/100g低加標(biāo)水平下，加標(biāo)回收率偏低，同時(shí)3個(gè)水平的數(shù)據(jù)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均大于4，數(shù)據(jù)離散程度大，不符合實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制要求;酶解樣品的加標(biāo)回收率為96.1%～108.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為3.18%～3.85%，加標(biāo)回收率比較好，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)精密度高。說(shuō)明，對(duì)于氨基酸配方特殊醫(yī)學(xué)用途配方乳粉A，只有酶水解樣品的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差符合實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制要求。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

目前市場(chǎng)上氨基酸及蛋白質(zhì)水解配方特殊醫(yī)學(xué)用途配方乳粉配料表中碳水化合物來(lái)源主要是以下幾種：麥芽糊精、預(yù)糊化淀粉、玉米糖漿、葡萄糖漿、白砂糖、乳糖和淀粉糖，其中添加最多的是麥芽糊精和葡萄糖漿。采用酶水解前處理方法，考察了多種品牌的氨基酸及蛋白質(zhì)水解配方特殊醫(yī)學(xué)配方乳粉或試制品左旋肉堿的檢測(cè)情況。

2.5.1 不同基質(zhì)樣品的精密度實(shí)驗(yàn)

考察了8種特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方乳粉，其中YA和YP樣品添加了乳糖、麥芽糊精和白砂糖，YPYB樣品添加了乳糖、固體玉米糖漿和麥芽糊精，YPYM樣品添加了固體玉米糖漿、預(yù)糊化淀粉和麥芽糊精，TT樣品只添加了葡萄糖漿，SMY和SLL添加了麥芽糊精和葡萄糖漿，AA樣品添加了麥芽糊精和預(yù)糊化淀粉，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

未酶解樣品，除了TT樣品，其他樣品過(guò)濾速度較慢，檢測(cè)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為3.04%～12.6%，數(shù)據(jù)離散程度大，精密度不好。對(duì)于酶解樣品，酶水解和沉淀蛋白后，均易于過(guò)濾，濾液澄清，檢測(cè)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.62%～3.75%，精密度比較好。

表1 2種前處理方法的左旋肉堿檢測(cè)結(jié)果

表2 加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

表3 2種前處理方法的左旋肉堿檢測(cè)結(jié)果

表4 加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6） %

2.5.2 不同基質(zhì)樣品的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

選取3種樣品，進(jìn)行酶水解前處理，在15 mg/100g添加水平進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，樣品加標(biāo)回收率結(jié)果見(jiàn)表4。

3種酶解樣品的加標(biāo)回收率為102.7%～108.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.76%～3.85%，加標(biāo)回收率比較好，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)精密度高。說(shuō)明對(duì)于不同基質(zhì)的氨基酸和蛋白質(zhì)水解配方特殊醫(yī)學(xué)配方乳粉中左旋肉堿的檢測(cè)，本方法具有比較好的準(zhǔn)確性和精密度。

3 結(jié) 論

采用Taka淀粉酶水解樣品的前處理方法簡(jiǎn)單、易于操作、干擾因素少。對(duì)于氨基酸及蛋白質(zhì)水解配方特殊醫(yī)學(xué)用途配方乳粉，該方法的精密度高，加標(biāo)回收率好。同時(shí)解決了氨基酸及蛋白質(zhì)水解配方特殊醫(yī)學(xué)用途配方乳粉過(guò)濾難和濾液不澄清的問(wèn)題，縮短了前處理時(shí)間，提高了檢測(cè)效率，靈敏度高，重復(fù)性好，滿足了氨基酸配方和蛋白質(zhì)水解配方特殊醫(yī)學(xué)配方乳粉中左旋肉堿批量化檢測(cè)需求[18-19]。