左澤紅 葉志偉 簡錦輝 萬 華 林俊芳 郭麗瓊* 云 帆

（1 華南農(nóng)業(yè)大學食品學院 廣州510642 2 華南農(nóng)業(yè)大學數(shù)信學院 廣州510642 3 廣東省微生態(tài)制劑工程技術研究中心 廣州510642 4 廣州市澳鍵豐澤生物科技股份有限公司 廣州510530）

蛹蟲草是一種珍貴的藥用真菌，富含多種生物活性物質，如蟲草多糖、蟲草酸、蟲草素和腺苷等[1]，具有抗癌、抗腫瘤、抗炎癥、免疫調節(jié)、抗氧化和抑菌等多種藥理作用[2]。研究表明，蛹蟲草呈黃色或橙黃色是因為體內(nèi)類胡蘿卜素的積累[3]。類胡蘿卜素是由類異戊二烯單位組成的碳氫化合物及其氧化衍生物的總稱，同樣具有抗炎、抗癌以及抗氧化等功效[4]?，F(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的類胡蘿卜素絕大部分是脂溶性類胡蘿卜素，人體難以直接吸收利用且大部分遇光和熱不穩(wěn)定[5-6]。蛹蟲草中的類胡蘿卜素有葉黃素[7]、玉米黃素[8]和北蟲草黃素[9]，前2 者屬于脂溶性類胡蘿卜素，而后者具有很強的親水性，并且其含量占蛹蟲草中總類胡蘿卜素含量的86.7%。與傳統(tǒng)類胡蘿卜素相比，其理論上具有更強的生理活性，能更好地被人體吸收并且生物利用度更高。固體發(fā)酵技術具有成本低，易于管理，后處理設備少等優(yōu)點，是一種經(jīng)濟、環(huán)保、有效的生產(chǎn)方式[10]，廣泛應用于各種生物活性成分的生產(chǎn)，然而，通過固體發(fā)酵技術生產(chǎn)類胡蘿卜素的方式還未曾報道。本研究采用固體發(fā)酵技術，通過篩選出的蛹蟲草菌株建立了一套蛹蟲草高產(chǎn)類胡蘿卜素固體發(fā)酵體系，為今后開發(fā)利用蛹蟲草中水溶性類胡蘿卜素提供科學數(shù)據(jù)。

1 試驗材料

1.1 試驗菌株

蛹蟲草菌種CM04，保藏于廣東省微生物制劑工程技術研究中心；CM09，購自北京吉蕈園科技有限公司；CM10，購自寧陽縣海鑫生物科技有限公司。

1.2 試驗試劑

瓊脂、葡萄糖、磷酸二氫鉀、蛋白胨、硫酸鎂、無水乙醇，購自廣州成碩生物工程有限公司。

1.3 儀器與設備

2 試驗方法

2.1 蛹蟲草培養(yǎng)方法

1）活化 將斜面或-80 ℃保存的原始菌株接種到PDA 固體平板培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫遮光培養(yǎng)至菌絲長滿培養(yǎng)皿，然后光照使其轉色，得到活化的菌種。

2）種子液的制備 在活化好長滿黃色菌絲的平板上，取3～4 塊黃豆粒大小的菌絲塊接種于PDA 液體培養(yǎng)基中，在25 ℃、150 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)4～5 d，待長滿菌絲球后可用于接種。

3）固體發(fā)酵 在組培瓶中加入按培養(yǎng)基配方準確稱取的各類谷物，加自來水充分攪拌均勻，121 ℃高壓滅菌40 min，冷卻至室溫后接種25%的蛹蟲草種子液，25 ℃暗培養(yǎng)7 d，打開光照，20℃繼續(xù)培養(yǎng)7 d 促使其轉色，產(chǎn)生類胡蘿卜素。

2.2 蛹蟲草類胡蘿卜素的提取及測定

將長滿蛹蟲草黃色菌絲的培養(yǎng)基質于55 ℃下烘48 h，粉碎后過30 目篩。稱取一定量的樣品，按料液比1∶20 加入60%的乙醇作為提取劑，25℃浸提過夜，8 000 r/min 離心10 min，上清液即類胡蘿卜素粗提取液，在波長470 nm 處測吸光值，類胡蘿卜素含量根據(jù)式（1）計算。

式中，A——吸光度；V——60%乙醇用量/mL；D——提取液稀釋陪數(shù)；E——消光系數(shù)（0.16）；W——樣品干重/g。

2.3 固體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

以大米為對照培養(yǎng)基配方CK，以蛹蟲草生長最適C/N 比20∶1 為原則，以大米、小麥、大豆、麩皮和玉米為培養(yǎng)料，根據(jù)各谷物原料的碳氮比[11]，設計各培養(yǎng)基配方（見表1），以類胡蘿卜素的含量為響應值確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方。

2.4 固體發(fā)酵條件的優(yōu)化

蛹蟲草的生長分為2 個階段：第1 階段是黑暗培養(yǎng)階段，此階段不需要光，因為光會抑制菌絲生長；第2 階段是光照培養(yǎng)階段，只有在光的作用下才能轉色，產(chǎn)生類胡蘿卜素或長出子實體。本試驗根據(jù)蛹蟲草的具體生長情況，分2 個階段優(yōu)化蛹蟲草產(chǎn)類胡蘿卜素的發(fā)酵條件。

表1 各培養(yǎng)基配方的原料組成Table 1 Raw material composition of each medium

2.4.1 第1 階段不同發(fā)酵條件對蛹蟲草產(chǎn)類胡蘿卜素的影響 以小麥（73%）、麩皮（20%）、玉米（7%）為培養(yǎng)基配方，研究不同基質顆粒度（0，10，30，50，70 目）、初始含水量（33%，50%，60%，67%，71%）、pH 值（4，5，6，7，8）、接種量（5%，15%，25%，35%，45%）、黑暗培養(yǎng)時間（5，7，9，11，13，15 d）、黑暗培養(yǎng)溫度（20，22，25，28，30 ℃）、裝料量（10，15，20，2，30 g）等條件對蛹蟲草CM10 產(chǎn)類胡蘿卜素的影響。其中，確定蛹蟲草初始發(fā)酵條件為：基質裝料量20 g，培養(yǎng)基質顆粒度0 目（即不粉碎過篩），初始含水量60%，培養(yǎng)基自然pH 值，接種量25%，黑暗培養(yǎng)時間7 d，黑暗培養(yǎng)溫度25℃，光照溫度20 ℃，光照時間7 d。固體發(fā)酵時，改變其中某一因素，待發(fā)酵結束后測定類胡蘿卜素含量，根據(jù)單因素結果研究各因素對蛹蟲草產(chǎn)類胡蘿卜素的影響。

還有一些矛盾的產(chǎn)生是由于工作責任的劃分，我所在的設備科室一向工作內(nèi)容是設計石油天然氣現(xiàn)場的各種梯子平臺等，然而實際上一些梯子與平臺并不完全適合于我們設備專業(yè)單獨完成，有的需要土建專業(yè)的配合，但是由于專業(yè)科室之間相互不信任的情況，這種類似的問題得不到有效合理的支持，一些設計可能需要較長時間的溝通，并召開多次會議，得到相關部門裁決的支持，才能得到有效的配合。這些工作都大大增加了一個正常設計工程的工作量，大量人力物力耗費在無意義的內(nèi)部爭議中，降低了工作效率。

2.4.2 響應曲面法（RSM）優(yōu)化類胡蘿卜素發(fā)酵條件 在單因素試驗的基礎上，確定基質顆粒度、初始含水量和黑暗培養(yǎng)時間的范圍，以類胡蘿卜素的含量為響應值，通過響應面曲面分析優(yōu)化發(fā)酵條件，試驗因素水平見表2。

表2 發(fā)酵條件Box-Behnken 因素和水平Table 2 Box-Behnken factors and levels of fermentation conditions

2.4.3 第2 階段不同發(fā)酵條件對蛹蟲草產(chǎn)類胡蘿卜素的影響 第2 階段影響蛹蟲草產(chǎn)類胡蘿卜素的主要因素是光照溫度和光照時間，因此，在第1階段最優(yōu)條件的基礎上研究了蛹蟲草在不同光照溫度（20，22，25，28 ℃）下隨光照時間增加時類胡蘿卜素含量的變化。

2.5 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 8.5 軟件處理數(shù)據(jù)和作圖，使用IBM SPSS Statistics 21 軟件分析數(shù)據(jù)的顯著性，使用Design Expert 8.0 軟件進行多元回歸和方差分析。

3 結果與分析

3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基

蛹蟲草CM04，CM09，CM10 在各培養(yǎng)基配方中類胡蘿卜素的產(chǎn)量如表3所示。蛹蟲草CM04在配方D 中類胡蘿卜素產(chǎn)量最高，達到199 μg/g，相對于對照組CK（110 μg/g），類胡蘿卜素產(chǎn)量明顯提高；蛹蟲草CM09 在配方L 中類胡蘿卜素產(chǎn)量最高，達到201 μg/g，是對照組CK（51 μg/g）產(chǎn)量的4 倍；蛹蟲草CM10 在配方L 中類胡蘿卜素產(chǎn)量最高，達到285 μg/g，是對照組CK（95 μg/g）產(chǎn)量的3 倍。最終選取蛹蟲草CM10 和其最優(yōu)培養(yǎng)基配方L（小麥73%、麩皮20%、玉米7%）優(yōu)化蛹蟲草固體發(fā)酵條件。

表3 蛹蟲草CM04，CM09，CM10 在各培養(yǎng)基中產(chǎn)類胡蘿卜素含量Table 3 Carotenoid content of Cordyceps militaris CM04，CM09 and CM10 in each medium

3.2 優(yōu)化的固體發(fā)酵條件

3.2.1 第1 階段不同發(fā)酵條件下菌株類胡蘿卜素產(chǎn)量

1）使用L 培養(yǎng)基配方，在保持基質裝料量20 g，初始含水量60%，自然pH，接種量25%，黑暗培養(yǎng)時間7 d，黑暗菌絲培養(yǎng)溫度25 ℃，光照溫度20 ℃，光照時間7 d等條件不變的情況下，基質粒度對蛹蟲草CM10類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響如圖1a所示。當基質粒度為10 目時，類胡蘿卜素產(chǎn)量達到最大值。0 目時雖然菌絲生長較快，但對基質的利用有限，如玉米等顆粒度較大的基質很難被利用。基質粒度超過30 目，達到50 目和70 目時，培養(yǎng)基易結塊，菌絲不能完全吃透，只能在培養(yǎng)基表面生長，類胡蘿卜素產(chǎn)量也隨之降低。最終，選取10 目作為最佳基質粒度。

2）使用L 培養(yǎng)基配方，在保持基質裝料量20 g，基質粒度0 目（即不粉碎過篩），自然pH，接種量25%，黑暗培養(yǎng)時間7 d，黑暗菌絲培養(yǎng)溫度25 ℃，光照溫度20 ℃，光照時間7 d等條件不變的情況下，基質初始含水量對蛹蟲草CM10類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響如圖1b所示。隨著基質初始含水量增加，類胡蘿卜素產(chǎn)量先增后減。當含水量為50%時，類胡蘿卜素的產(chǎn)量達到最大值。一般來說，水分不足，基質過于干燥，導致菌絲生長不良；水分過高，由于重力作用，培養(yǎng)基質顆粒密度小的易粘成團，影響發(fā)酵，故過高或過低的基質初始水分含量均會導致類胡蘿卜素產(chǎn)量量降低[12]。最終選取50%作為基質最佳初始含水量。

圖1 第1 階段不同發(fā)酵條件對蛹蟲草類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of different fermentation conditions on the carotenoid yield of Cordyceps militaris in first stage

3）使用L 培養(yǎng)基配方，在保持基質裝料量20 g，基質粒度0 目，初始含水量60%，接種量25%，黑暗培養(yǎng)時間7 d，黑暗菌絲培養(yǎng)溫度25℃，光照溫度20 ℃，光照時間7 d等條件不變的情況下，基質初始pH 對蛹蟲草CM10類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響如圖1c所示：當pH 為4 或8 時，類胡蘿卜素產(chǎn)量相對較低。當pH 為5 和7 時，類胡蘿卜素產(chǎn)量達到最大值。pH 為6 時雖與pH 值為5 和7 差異顯著，但也僅比二者少8%和3%。在不調節(jié)pH 值的情況下，培養(yǎng)基的自然pH 處于6～7 之間。Xie等[13]的研究表明蛹蟲草在固體培養(yǎng)時菌絲生長最適pH 為6.2。故綜合考慮，蛹蟲草固體發(fā)酵產(chǎn)類胡蘿卜素過程中無需調節(jié)基質初始pH，保持自然pH 即可。

4）使用L 培養(yǎng)基配方，在保持基質裝料量20 g，基質粒度0 目，初始含水量60%，自然pH，黑暗培養(yǎng)時間7 d，黑暗培養(yǎng)溫度25 ℃，光照溫度20 ℃，光照時間7 d等條件不變的情況下，接種量對蛹蟲草CM10類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響如圖1d所示。當接種量從5%增加到25%時，類胡蘿卜素的產(chǎn)量隨之增加。當接種量大于25%時，類胡蘿卜素的產(chǎn)量呈下降趨勢，可能是因為接種量過大，菌絲過快生長，使得基質難以提供充足的營養(yǎng)供發(fā)酵后期生產(chǎn)類胡蘿卜素。最終選取25%作為最佳接種量。

5）使用L 培養(yǎng)基配方，在保持基質裝料量20 g，基質粒度0 目，初始含水量60%，自然pH，接種量25%，黑暗培養(yǎng)溫度25 ℃，光照溫度20℃，光照時間7 d等條件不變的情況下，菌絲黑暗培養(yǎng)時間對蛹蟲草CM10類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響如圖1e所示。隨著黑暗生長時間的增加，類胡蘿卜素的產(chǎn)量也不斷增加。當菌絲黑暗生長到13 d時，類胡蘿卜素產(chǎn)量達到最大值。若繼續(xù)增加黑暗培養(yǎng)時間，類胡蘿卜素的產(chǎn)量開始下降，可能是因為此時菌絲已到衰亡期，分泌次級代謝產(chǎn)物類胡蘿卜素的能力急劇下降。根據(jù)顯著性分析結果可知，黑暗培養(yǎng)11 d 和13 d 的類胡蘿卜素產(chǎn)量沒有顯著性差異，因此為減少培養(yǎng)時間，選取11 d 作為最適菌絲黑暗培養(yǎng)時間。

6）使用L 培養(yǎng)基配方，在保持基質裝料量20 g，基質粒度0 目，初始含水量60%，自然pH，接種量25%，黑暗培養(yǎng)時間7 d，光照溫度20 ℃，光照時間7 d等條件不變的情況下，菌絲黑暗生長溫度對蛹蟲草CM10類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響如圖1f所示。當溫度為22 ℃時，類胡蘿卜素的產(chǎn)量達到最大值。隨著溫度逐漸升高，類胡蘿卜素的產(chǎn)量也逐漸降低，并且在30 ℃時達到最低值，此時菌絲生長受到抑制。最終，選取22 ℃為菌絲最佳黑暗生長溫度。

7）使用L 培養(yǎng)基配方，在保持基質粒度0目，初始含水量60%，自然pH，接種量25%，黑暗培養(yǎng)時間7 d，黑暗培養(yǎng)溫度25 ℃，光照溫度20℃，光照時間7 d等條件不變的情況下，裝料量對蛹蟲草CM10類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響如表4所示。當裝料量為15 g 時，類胡蘿卜素的單位產(chǎn)量最高。隨著裝料量增加，類胡蘿卜素單位產(chǎn)量逐漸降低。雖然裝料量為15 g 時類胡蘿卜素的單位產(chǎn)量最高，但此時收集的樣品總量不多，而根據(jù)類胡蘿卜素理論總量，得出裝料量為25 g 時類胡蘿卜素總量最高。最終，選取25 g 為最適裝料量。

表4 不同裝料量條件下蛹蟲草類胡蘿卜素的產(chǎn)量Table 4 The yield of carotenoid of Cordyceps militaris under different loadings conditions

3.2.2 響應面Box-Behnken 設計優(yōu)化的試驗結果根據(jù)表5 試驗結果，采用Design-Expert 8.0 軟件進行回歸分析，得到響應面二次多元回歸方程：Y = 286.20 - 7.12A- 16.75B + 9.13C - 14.25AB -8.50AC+6.25BC-28.85A2-36.10B2-15.85C2。對該模型進行方差分析，結果如表6所示。模型F=4.78，P=0.0256＜0.05，說明模型顯著；失擬項P=0.2996＞0.05，說明模型失擬項不顯著；決定系數(shù)R2=0.8601，說明模型與實際情況擬合程度較好；顯著的模型項為B、A2、B2（P＜0.05）；因素F 關系為F（B）＞F（C）＞F（A），說明3 個因素對蛹蟲草類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響由大到小依次為基質初始含水量、黑暗菌絲培養(yǎng)時間和基質顆粒度。根據(jù)軟件分析得到第1 階段蛹蟲草固體發(fā)酵產(chǎn)類胡蘿卜素的最佳培養(yǎng)條件為：基質顆粒度為10 目，基質初始含水量為47.88%，黑暗培養(yǎng)時間為12.49 d。結合實際情況，確定下一步最佳固體發(fā)酵條件為：基質顆粒度10 目，基質初始含水量48%，黑暗培養(yǎng)時間12 d。

表5 響應面Box-Behnken 設計優(yōu)化分析方案和試驗結果Table 5 Optimization analysis scheme and test results of response surface Box-Behnken design

表6 回歸方程的方差分析Table 6 Analysis of variance of regression equation

采用軟件Design-Expert 進行二次多元回歸擬合，得到的響應面圖及等高線圖（圖2）。由圖2a可知：黑暗培養(yǎng)時間一定時，響應曲面的等高線稀疏和坡度緩和，表明類胡蘿卜素含量受基質粒度和初始含水量交互作用的影響最弱。從圖2b可知：當初始含水量一定時，響應曲面的等高線較密集和坡度較陡，表明類胡蘿卜素含量受黑暗培養(yǎng)時間和基質粒度交互作用最強。從圖2c可知：當基質粒度一定時，響應曲面的等高線稀疏，表明類胡蘿卜素含量受黑暗培養(yǎng)初始含水量交互作用的影響較弱。

圖2 各因素對蛹蟲草類胡蘿卜素產(chǎn)量影響的響應面圖及等高線圖Fig.2 Response surface and contour plot showing the effects of various factor on the carotenoids yields of Cordyceps militaris

3.2.3 第2 階段蛹蟲草固體發(fā)酵產(chǎn)生類胡蘿卜素的發(fā)酵條件 使用第1 階段優(yōu)化的培養(yǎng)條件，即L 培養(yǎng)基配方，基質裝料量25 g，基質顆粒度10目，初始含水量48%，自然pH，接種量25%，黑暗培養(yǎng)時間12 d，黑暗培養(yǎng)溫度22 ℃，蛹蟲草CM10 在第2 階段固體發(fā)酵產(chǎn)類生胡蘿卜素的結果如圖3所示。當光照溫度為25 ℃時，培養(yǎng)14 d的菌株類胡蘿卜素產(chǎn)量達最大值；而在14 d 以后，光照溫度為25 ℃時類胡蘿卜素產(chǎn)量略有降低，可能是因為此時底物主要被用于蛹蟲草子實體的生長。根據(jù)本試驗結果，選取最適光照溫度為25 ℃，最適光照時間為14 d，此時類胡蘿卜素產(chǎn)量最高，即346 μg/g。

圖3 不同光照溫度下光照時間對蛹蟲草類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of light time on carotenoid yields of Cordyceps militaris at different light temperatures

4 討論

類胡蘿卜素是一類具有多種生物學功能的色素，作為食品添加劑和營養(yǎng)增補劑廣泛應用于食品及醫(yī)療保健行業(yè)中。類胡蘿卜素的來源主要有3種形式：植物提取、化學合成和微生物發(fā)酵。化學法合成的類胡蘿卜素生物活性低且存在質量安全隱患；植物中提取的類胡蘿卜素雖然生物活性高，但是提取工藝復雜、產(chǎn)率低；微生物發(fā)酵產(chǎn)生的類胡蘿卜素產(chǎn)量高、安全性好，是生產(chǎn)類胡蘿卜素的最好方法。目前，國內(nèi)外利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素的菌株有紅酵母、三孢布拉霉、分支細菌和短桿菌等，均采用液體發(fā)酵的方式，而液體發(fā)酵成本高，對設備的要求高。與之相比，固體發(fā)酵原料低價易得，工藝簡單，成本低。Liu等[14]以茶籽（52.48%）、豆渣（29.38%）和米糠（18.54%）為固體發(fā)酵基質，將粗糙脈孢菌和植物乳桿菌混合發(fā)酵74.9 h，通過HPLC 在發(fā)酵后的基質中鑒定出15種類胡蘿卜素。謝愛娣[15]以紅酵母菌株D 為發(fā)酵菌種，確定了固體發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素的最佳培養(yǎng)基組分為m啤酒糟︰m豆粕︰m麩皮=1︰3︰2，含水量為60%，添加K2HPO4和MgSO4的質量濃度分別為2.00 g/L 和0.50 g/L；最佳培養(yǎng)條件為豆粕20目，麩皮和啤酒糟混合篩分，裝量為20 g/250 mL三角瓶，接種齡為24 h，接種量為15%，自然pH，溫度25 ℃培養(yǎng)96 h，在該最優(yōu)條件下所得類胡蘿卜素產(chǎn)量為32 mg/kg。本研究利用可食用的谷物作為培養(yǎng)基，通過篩選出的蛹蟲草菌株建立了一套蛹蟲草高產(chǎn)類胡蘿卜素固體發(fā)酵體系，最終產(chǎn)量為346 μg/g。與謝愛娣[15]的研究相比，產(chǎn)量提高了10 倍，并且本研究所選用培養(yǎng)基未添加任何化學試劑，綠色安全，成本低，具有可行性。

光照條件是蛹蟲草產(chǎn)類胡蘿卜素的一個必要條件。Shrestha等[16]曾報道光是決定蛹蟲草菌絲體密度、質地和色素的關鍵因素，黑暗條件下菌絲體不會產(chǎn)生色素。付鳴佳[3]發(fā)現(xiàn)蛹蟲草在光照培養(yǎng)下菌落呈橙黃色是由于菌絲中類胡蘿卜素的積累所致。影響蛹蟲草類胡蘿卜素生物合成的光照條件包括光質、光強、光照時間和光照溫度等。張金艷[17]研究了光照強度對蛹蟲草生產(chǎn)類胡蘿卜素的影響，發(fā)現(xiàn)隨著光照強度的不斷增加，蛹蟲草類胡蘿卜素的產(chǎn)量也隨之提高。Dong等[18]的研究發(fā)現(xiàn)相較于藍光和紅光，粉光（1/3 藍光+2/3 紅光）更顯著促進蛹蟲草子實體中類胡蘿卜素的積累。本文只研究了光照時間和光照溫度對蛹蟲草類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響，并未深入研究光強和光質的影響。在本研究的基礎上，通過增加光強或改變光質提高蛹蟲草類胡蘿卜素的產(chǎn)量，還有待深入研究。

目前，關于蛹蟲草類胡蘿卜素的提取研究多集中于子實體和菌絲體上，且大多使用丙酮和石油醚等不可食用的有機溶劑[19-20]，而關于蛹蟲草固體發(fā)酵菌粉中類胡蘿卜素的提取尚未見報道。本試驗采用乙醇浸提法提取蛹蟲草固體發(fā)酵菌粉中的類胡蘿卜素，粗提液經(jīng)波長掃描后具有類胡蘿卜素特征吸收峰，說明浸提出來的物質是類胡蘿卜素。本方法簡單、實用，提取溶劑乙醇綠色、安全，易被消費者接受。