北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所（101111）孫莉

北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所 醫(yī)療器械檢驗(yàn)與安全性評價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（101111）王軍

膠體金免疫試劑的快速發(fā)展引起國家監(jiān)督機(jī)構(gòu)的高度重視，為促進(jìn)行業(yè)的健康發(fā)展，先后制定《促黃體生成素檢測試劑（膠體金免疫層析法）注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則》、《心肌肌鈣蛋白I/肌紅蛋白/肌酸激酶同工酶MB檢測試劑（膠體金免疫層析法）注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則》、YY/T1423-2016《幽門螺旋桿菌抗體檢測試劑盒（膠體金法）》和YY/T1525-2017 《甲基安非他明檢測試劑盒（膠體金法）》等多項(xiàng)指導(dǎo)原則和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。除此之外，國家食品藥品監(jiān)督管理局于2013年發(fā)布的《金標(biāo)類檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則》及全國醫(yī)用臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室和體外診斷系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)于2018年制定的《膠體金免疫層析法檢測試劑盒》（報(bào)批中）均對定性、半定量、定量膠體金免疫試劑盒提出了整體規(guī)范。

考慮到不同類產(chǎn)品檢驗(yàn)性能的差異，本文中僅討論通過肉眼可進(jìn)行判讀的定性膠體金試條在檢測中遇到的問題并簡要分析。

1 技術(shù)指標(biāo)

膠體金定性試條在檢驗(yàn)中一般涉及指標(biāo)有：物理性狀（包括外觀、寬度、移行速度），陽性符合率，陰性符合率，檢出限，重復(fù)性[1]。

寬度：一般使用游標(biāo)卡尺檢測試紙條寬度，大部分為不小于3mm。寬度指標(biāo)的設(shè)置是為了便于觀察、實(shí)現(xiàn)可視化、方便判讀。

移行速度：樣本通過試條某一長度的速度，一般為大于10mm/min。滴加樣本后，使用秒表計(jì)時(shí)，到達(dá)企業(yè)聲稱長度結(jié)束。單條檢測或多條檢測結(jié)果取均值。

陽性符合率：檢測陽性參考品/樣品各一次，結(jié)果應(yīng)均為陽性。陽性參考品的設(shè)置應(yīng)分強(qiáng)陽、中陽和弱陽。

陰性符合率：檢測不同陰性參考品/樣品，應(yīng)考慮到相對報(bào)陽項(xiàng)目而言所有陰性樣本情況進(jìn)行參考品設(shè)置，檢測結(jié)果應(yīng)均為陰性。

檢出限：檢出限是指由給定測量程序得到的測得量值，對于此值，在給定聲稱物質(zhì)中存在某成分的誤判概率為α?xí)r，聲稱不存在該成分的誤判概率為β。它被用于描述一個(gè)檢驗(yàn)程序以特定置信水平能報(bào)告為存在的被測量的最低值，也被用來指最小可檢測濃度[2]。檢測不同濃度/水平梯度的參考品/樣品，結(jié)果應(yīng)滿足制造商聲稱。檢出限參考品應(yīng)包括臨界值的兩側(cè)C5、C95[3]。

重復(fù)性：在一組測量條件下的測量精密度，包括相同測量程序、相同操作者、相同測量系統(tǒng)、相同操作條件和相同地點(diǎn)，并且在短時(shí)間段內(nèi)對同一或相似被測對象重復(fù)測量。檢測已明示濃度/水平的陰性及弱陽性參考品/樣品至少10次[2]，陰陽性結(jié)果符合率應(yīng)不小于95%。一般企業(yè)選擇一個(gè)濃度或多個(gè)濃度水平，濃度設(shè)置在臨床閾值上下，保證臨床使用中多次檢測的穩(wěn)定性。

2 發(fā)現(xiàn)的問題

在膠體金診斷試劑突飛發(fā)展的同時(shí)，也暴露出了一些問題。筆者從事醫(yī)療器械檢驗(yàn)工作多年，選擇近兩年檢測膠體金定性試紙條中出現(xiàn)的問題，簡單介紹如下。

膠體金試條寬度均達(dá)到企業(yè)技術(shù)要求，爬行速度三家未達(dá)到要求，其中一家爬板中止，兩家爬行速度大于10mm/min。見附圖1。

檢測中少量膠體金試條在陽性符合率和陰性符合率指標(biāo)上還出現(xiàn)假陰或假陽結(jié)果以及質(zhì)控線無顯示和背景嚴(yán)重的情況。檢出限中低水平樣本檢測結(jié)果不符合要求。見附圖2。

檢測過程中重復(fù)性樣本個(gè)別顯色不一致。見附圖3。

附圖1 爬板中止膠體金試條圖示

附圖2 質(zhì)控C線未出及背景花膠體金試條圖示

附圖3 重復(fù)性顯色不一致膠體金試條圖示

3 問題討論

出現(xiàn)以上問題的原因比較復(fù)雜，抗原、抗體的配對篩選是決定膠體金試劑免疫反應(yīng)的關(guān)鍵因素，一直以來也備受重視，此處不再贅述。除此之外，還應(yīng)結(jié)合膠體金檢測試條的結(jié)構(gòu)及生產(chǎn)過程，從多方面討論形成上述問題的原因。首先簡單介紹膠體金定性試條常規(guī)結(jié)構(gòu)。

膠體金檢測試紙條結(jié)構(gòu)一般以塑料板為底板，硝酸纖維素膜（NC膜）貼于底板的中間，再將吸水膜和試劑墊分別粘貼于纖維素膜的縱向兩端，吸水膜與NC膜以及NC膜與試劑墊在其交界處有重疊連接。在NC膜與試劑墊的連接處粘貼膠紙用作控流。樣本中的待測物質(zhì)通過與金標(biāo)物的特異性結(jié)合形成聚合物，在硝酸纖維素膜上擴(kuò)散，最終到達(dá)C、T線與包被物結(jié)合，顯示肉眼可見條帶。

3.1 假陽性、背景問題 結(jié)合其結(jié)構(gòu)分析造成上述問題中假陽、背景嚴(yán)重的原因有非特異性結(jié)合。膠體金層析基質(zhì)要根據(jù)包被蛋白的不同進(jìn)行選擇，常見的有硝酸纖維素膜或硝酸纖維素/醋酸纖維素混合膜。膜的孔徑越小，膜的實(shí)際可用面積遞增，膜結(jié)合蛋白的量也遞增，層析速度慢，反應(yīng)越充分，但同時(shí)減慢了跑板速度，增加了非特異性結(jié)合的機(jī)會(huì)，可能會(huì)出現(xiàn)假陽[4]。部分企業(yè)在研發(fā)階段會(huì)根據(jù)檢測項(xiàng)目對膜進(jìn)行封閉設(shè)計(jì)。對膜封閉可以減少非特異性結(jié)合，但同時(shí)可能影響膜內(nèi)正常物質(zhì)分布。同時(shí)，膠體金顆粒制備過程中受操作環(huán)境和容器具潔凈度的影響較大，容易出現(xiàn)金顆粒聚集情況。標(biāo)記抗體的純度也會(huì)影響標(biāo)金過程導(dǎo)致蛋白與金顆粒標(biāo)記不完整或發(fā)生金聚集，當(dāng)金顆粒發(fā)生聚集時(shí)會(huì)在膜條上發(fā)生非特異性結(jié)合。

3.2 假陰、質(zhì)控C線無顯示 造成上述問題中假陰、質(zhì)控線無顯示的原因可考慮流速過快，未充分反應(yīng)，包被T線、C線中特異性成分不足。包被T線、C線抗原或抗體的量要相對飽和，包被后要徹底干燥。包被濃度過低，膜上的條帶會(huì)出現(xiàn)顯色不清晰或條帶中空現(xiàn)象，此外，夾心法膠體金試條其包被濃度過高也可能由于HOOK效應(yīng)不顯色或出現(xiàn)拖帶現(xiàn)象[5]。

3.3 檢出限不符合要求 檢出限參考品不符合企業(yè)要求，說明企業(yè)在研發(fā)階段確定的檢出限可能存在問題。建議采用科學(xué)方法在大量驗(yàn)證的基礎(chǔ)上確定企業(yè)的檢出限。檢出限與臨床使用關(guān)系緊密，直接影響臨床判定。應(yīng)當(dāng)注意設(shè)置檢出限應(yīng)結(jié)合臨床實(shí)際使用，根據(jù)項(xiàng)目確定，區(qū)分篩查試劑和確認(rèn)試劑[3]。

3.4 爬行速度過慢 爬行速度不符合要求的原因可以考慮控流的粘貼膠紙貼合不合適或試條外殼壓得過緊，甚至可能出現(xiàn)不爬板或爬一部分。同時(shí)，樣本性質(zhì)及加樣量對結(jié)果也會(huì)產(chǎn)生影響。血漿中含有大量的纖維蛋白原，影響到層析速度及均一性，可能出現(xiàn)非特異性結(jié)合，檢測時(shí)樣品的添加量要相對充足，加樣量過低會(huì)導(dǎo)致試紙條上層析不充分而出現(xiàn)假陰性，或不爬板。

3.5 重復(fù)性顯色不一致 重復(fù)性顯色不一致可能由于生產(chǎn)時(shí)工藝控制不嚴(yán)格，導(dǎo)致膠體金試紙條出廠差異大所致，也可能是操作人在上樣時(shí)的操作時(shí)間、上樣量、實(shí)驗(yàn)環(huán)境控制不精準(zhǔn)。

此外，生產(chǎn)工藝中應(yīng)注意膠體金試紙條結(jié)合墊應(yīng)能很好地負(fù)載膠體金標(biāo)記物和待測樣本且不被吸附，通常選擇較多的是玻璃纖維素膜。要根據(jù)實(shí)際檢測樣品性質(zhì)選擇合適的樣品墊和吸水紙，保證樣本快速流動(dòng)而不被非特異性吸附，吸水紙則要有很好地蓄水能力，保證所有樣本充分流膜的反應(yīng)區(qū)。

除上述從生產(chǎn)工藝方面的分析外，檢測過程中的溫濕度對結(jié)果也有影響，尤其是濕度對膠體金試紙條的影響很大，因此成品試條都進(jìn)行了防潮設(shè)計(jì)，一般長時(shí)間存放都要求避光、密封。在檢驗(yàn)操作中應(yīng)嚴(yán)格遵照廠家在大量實(shí)驗(yàn)中摸索出的檢測條件，包括加樣量、反應(yīng)時(shí)間及檢測環(huán)境溫濕度等。

4 結(jié)論與展望

綜上所述，膠體金定性免疫試紙條在檢驗(yàn)過程中出現(xiàn)的問題主要集中在假陰性、假陽性、檢出限不符合要求、質(zhì)控C線不顯示、重復(fù)性指標(biāo)顯色不一致等方面。這些問題會(huì)對臨床及患者產(chǎn)生各種影響。如臨床使用中出現(xiàn)假陽判定可能會(huì)引起不必要的后續(xù)檢測、治療，使患者經(jīng)受精神、身體、經(jīng)濟(jì)等多方面痛苦，同時(shí)浪費(fèi)有限的醫(yī)療資源；重復(fù)性指標(biāo)考察試劑盒的穩(wěn)定性，在臨床使用過程中，試劑穩(wěn)定能夠盡量降低單次檢測誤判的可能性，提高復(fù)測一致的結(jié)果可信性；定性膠體金試紙條大多數(shù)為肉眼判讀，背景嚴(yán)重將影響條帶顯色，分辨不出弱陽樣本造成漏檢，甚至錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī)；假陰性結(jié)果會(huì)影響醫(yī)生后期的整體判定，特別是某些臨床急癥項(xiàng)目的漏報(bào)，延誤患者治療時(shí)機(jī)，甚至威脅生命健康。

因此，為了促進(jìn)膠體金免疫試紙條的行業(yè)發(fā)展，企業(yè)應(yīng)從以下幾方面引起重視：①加大研發(fā)階段投入，篩選最優(yōu)配對抗原抗體，充分驗(yàn)證反應(yīng)條件，優(yōu)化生產(chǎn)工藝，認(rèn)真進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估。②做好供應(yīng)商評價(jià)，制定有針對性的來料檢驗(yàn)規(guī)程。③設(shè)定出廠放行檢驗(yàn)指標(biāo)時(shí)應(yīng)選擇有意義的項(xiàng)目進(jìn)行客觀評價(jià)，不宜將指標(biāo)放得過寬，等于甚至低于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求。④企業(yè)內(nèi)控部質(zhì)控盤的設(shè)定應(yīng)盡量貼近臨床實(shí)際使用情況，考慮個(gè)體差異性，考慮臨床常見干擾項(xiàng)目及弱陽性樣本。⑤在檢測過程中，很多企業(yè)忽視了HOOK效應(yīng)，但對于抗體夾心法的膠體金免疫試條，HOOK效應(yīng)明顯，容易出現(xiàn)假陰誤判，建議企業(yè)根據(jù)產(chǎn)品實(shí)際情況，增加該項(xiàng)指標(biāo)。作為檢測機(jī)構(gòu)工作者應(yīng)注意：①嚴(yán)格按照企業(yè)說明操作，控制反應(yīng)環(huán)境及時(shí)間。②與時(shí)俱進(jìn)，了解行業(yè)進(jìn)展及前沿技術(shù)革新。生產(chǎn)者、經(jīng)營者、監(jiān)管者的協(xié)同推進(jìn)才能促進(jìn)行業(yè)穩(wěn)步向前發(fā)展。

科技革新推動(dòng)膠體金免疫試劑配套儀器的研制，使其迎來定量時(shí)代。但受其技術(shù)本身的限制，化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法在靈敏度、特異性等方面都明顯優(yōu)于膠體金免疫定量法[6]。線性范圍窄，在弱陽性上的表現(xiàn)性較差，結(jié)果容易受到操作人及檢測環(huán)境影響等都限制著膠體金在精準(zhǔn)定量領(lǐng)域的發(fā)展。另一方面，靈活的檢驗(yàn)形式和簡單快速、準(zhǔn)確直觀、成本低廉等優(yōu)勢決定了膠體金免疫試劑在POCT領(lǐng)域的廣泛發(fā)展，尤其是近年來隨著醫(yī)療模式和健康理念的轉(zhuǎn)變、膠體金免疫試劑這種更成熟、更快捷、更經(jīng)濟(jì)的檢驗(yàn)技術(shù)在POCT的更多領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用：①在臨床急診和重癥醫(yī)學(xué)的醫(yī)療護(hù)理中，膠體金免疫試條可縮短診斷時(shí)間，實(shí)現(xiàn)床旁實(shí)時(shí)檢測，達(dá)到快速診治的目的，提高醫(yī)療工作效率和患者滿意度。②在突發(fā)公共衛(wèi)生事件的生物應(yīng)急領(lǐng)域，膠體金免疫試條檢測已成為傳染病突發(fā)疫情處置、災(zāi)害醫(yī)學(xué)救援、食品安全事故、生物反恐應(yīng)急、檢驗(yàn)檢疫、違禁藥品篩查以及野戰(zhàn)檢驗(yàn)等應(yīng)急條件下先遣急救者的首選[7]。