黃玉坤 ，宋亞寧，陳 芳,3，王力均，楊 瀟，車振明，陳祥貴

（1.西華大學食品與生物工程學院，四川 成都 610039；2.宜賓西華大學研究院，食品非熱加工重點實驗室，食品非熱加工工程技術(shù)研究中心，四川 宜賓 644004；3.成都康弘藥業(yè)集團股份有限公司，四川 成都 610036）

生物胺（biogenic amines，BAs）是一類堿性含氮的低分子量低生物活性的極性或半極性化合物，可在食品腐爛或發(fā)酵過程中由不同的微生物誘導產(chǎn)生[1-2]，包括革蘭氏陰性菌、腸桿菌、假單胞桿菌和乳酸菌等[3]。BAs形成途徑主要依靠氨基酸脫羧以及醛或酮的轉(zhuǎn)氨基作用[4]。研究表明，適量BAs可調(diào)節(jié)人體正常生理功能，但過量BAs會在體內(nèi)激發(fā)其潛在的毒性作用[5]，如過敏、血管毒性和神經(jīng)毒性等[6]。BAs中組胺和酪胺毒性最強，并且當腐胺和尸胺同時存在時會抑制組胺降解而進一步加強組胺和酪胺毒性[7]。另外，有關(guān)研究[8]表明，BAs含量增加會增大誘發(fā)癌癥的可能性。目前國內(nèi)外僅對少部分食品的個別BAs確定了推薦最高攝入量[9]，大部分BAs沒有限量標準。鑒于BAs具有個體差異以及不同BAs之間具有協(xié)同作用而產(chǎn)生的毒性，檢測食品中BAs含量以及建立發(fā)酵制品BAs推薦攝入量就具有重要意義。

BAs存在于動植物及其制品[10-12]、乳酪及其制品[13-14]、發(fā)酵飲料[15-16]、巧克力及咖啡[6]、發(fā)酵豆腐乳[17-18]等多種食物中。在醬油[19]、醋[20]、豆豉[21]、黃豆醬[22]和韓國大醬[23]等發(fā)酵豆制品中的BAs被廣為研究，但在基質(zhì)更為復雜的郫縣豆瓣中的BAs未見深入研究。郫縣豆瓣是四川傳統(tǒng)特色發(fā)酵調(diào)味品，在世界“發(fā)酵辣椒醬”中獨樹一幟，深受大家的喜愛[24]。但由于采用自然發(fā)酵工藝，環(huán)境中各種能產(chǎn)生氨基酸脫羧酶的微生物可能參與發(fā)酵過程，并且原料富含蛋白質(zhì)，在基于發(fā)酵的過程中蛋白酶的持續(xù)分解作用使豆瓣醬中氨基酸態(tài)氮含量逐漸增加，最終導致豆瓣醬中BAs可能超量[5]。李冉冉等[2]等采用了響應面法優(yōu)化丹磺酰氯衍生生物胺的衍生條件，針對生臘肉中生物胺的衍生做了相應研究。曾雪晴等[5]研究了21種郫縣豆瓣醬中BAs的含量和種類，其中個別樣品中的組胺、酪胺及 β-苯乙胺的含量超過了建議范圍，對人體健康有不良影響。另外，研究[5,25]表明腐胺、尸胺、以及毒性較高的酪胺和組胺是郫縣豆瓣醬中主要的生物胺。因此，建立檢測傳統(tǒng)發(fā)酵豆瓣中生物胺含量的有效方法對食品安全具有重要意義。

目前國內(nèi)外對于BAs的檢測法主要分為色譜法，包括高效液相色譜法（HPLC）、超高效液相色譜法（UPLC）、薄層色譜法（TLC）、離子色譜法（IC）等；串聯(lián)質(zhì)譜法，包括高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS/MS）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）等；其他方法，包括生物傳感器法、毛細管電泳法（CE）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）等[26]。近年出現(xiàn)的新型方法有納米纖維膜試紙技術(shù)、競爭性熒光分子印跡聚合物（MIP）技術(shù)、高光譜成像技術(shù)等[2]。因高效液相色譜法檢測成本低、操作簡單，經(jīng)常被基層、企業(yè)等作為常用檢測方法[27]。BAs屬于強極性化合物，無法在反相柱上得到保留[28]，且BAs本身沒有紫外吸收和熒光發(fā)射特性，需經(jīng)衍生化反應后才能進行HPLC測定；因此，選擇合適的提取溶劑并優(yōu)化BAs的色譜衍生條件，有利于提高基于HPLC技術(shù)分析郫縣豆瓣中BAs含量方法的靈敏度。

1 材料、儀器與方法

1.1 材料與試劑

郫縣豆瓣樣品（A：發(fā)酵2.5年；B：發(fā)酵1.5年；C：發(fā)酵0.5年）采樣自四川省某公司生產(chǎn)的郫縣豆瓣醬；組胺（Histamine，His，純度≥99%）購自上海生工生物工程股份有限公司；酪胺（Tyramine，Tyr）、色胺（Tryptamine，Trp）、腐胺（Putrescine，Put）、尸 胺（Cadaverine，Cad）、精 胺（Spermine，Spm）、亞精胺（Spermidine，Spd）、β-苯乙胺（βphenylethylamine，Phe）、丹磺酰氯（（Dansyl Chloride，Dns-Cl，純度均≥98%）購自上海麥克林生化科技有限公司；甲醇（色譜純）、丙酮（色譜純）、乙腈（色譜純）購自美國Sigma公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀（Waters 2 695），美國 Waters公司；5810R 冷凍離心機，德國 Eppendorf 公司；VORTEX 3渦旋混勻器，德國 IKA；顯數(shù)式 pH 計，成都世紀方舟科技有限公司；HN132樣品濃縮儀，濟南海能儀器股份有限公司；電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；Milli-Q 超純水處理器，美國 Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

標準儲備液：準確稱取各BAs標準品100 mg（精確到0.001 g），用0.1 mol/L鹽酸溶解后定容到10 mL容量瓶?；旌蠘藴嗜芤海悍謩e移取各標準儲備液1 mL置于10 mL容量瓶，用0.1 mol/L鹽酸定容至刻度，再用0.1 mol/L鹽酸逐級稀釋至最終質(zhì)量濃度分別為1 000、500、200、100、50、10 mg/L的混合標準溶液，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品預處理

準確稱取5 g均質(zhì)豆瓣樣品置于50 mL離心管中，加入10 mL 5%三氯乙酸（TCA）渦旋混勻，超聲提取20 min后離心（4 ℃，5 000 r/min，10 min），轉(zhuǎn)移上清液置于25 mL容量瓶，下層再萃取1次，合并2次上清液，用5% TCA定容至刻度，混勻，待衍生。

1.3.3 衍生

衍生過程參考GB 5 009.208—2016[19]并作進一步探索和優(yōu)化。準確量取1.0 mL樣品置于離心管中，依次加入1 mL飽和碳酸氫鈉溶液（用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為8.93）、1 mL Dns-Cl（質(zhì)量濃度為12.45 mg/mL），渦旋混勻后置于41 ℃恒溫水浴鍋中衍生37.95 min，取出，分別加入100 μL谷氨酸鈉溶液，渦旋混勻，41 ℃恒溫反應15 min，取出冷卻至室溫，于每個離心管中加入1 mL 超純水，渦旋混勻，40 ℃下氮氣濃縮除去丙酮，加入0.5 g氯化鈉渦旋振蕩至完全溶解，再加入5 mL無水乙醚，渦旋振蕩2 min，靜置分層后，轉(zhuǎn)移上層有機相于10 mL離心管中，下層水相再萃取1次，合并2次乙醚萃取液，40 ℃下氮氣吹干。加入1 mL乙腈復溶，0.22 μm 濾膜針頭濾器過濾，待上機測定。

1.3.4 單因素實驗設計

根據(jù)前期預實驗確定研究水平即衍生提取溶劑為5% TCA、0.4 mol/L高氯酸、丙酮、無水乙醇、無水甲醇和乙腈，衍生試劑Dns-Cl質(zhì)量濃度為3、7、11、15和25 mg/mL，衍生體系pH值為8、9、10、11和12，衍生溫度為20、40、60、80、100 ℃，衍生時間為10、20、30、40和50 min。實驗每組平行測定3次，以8種BAs總面積為響應值確定最佳實驗水平。

1.3.5 響應面實驗設計

結(jié)合單因素實驗結(jié)果，Box-Behnken中心組和實驗設計原理，設計四因素三水平（共29個實驗點，5個區(qū)域中心點），以8個生物胺濃度平均響應值為指標（Y，mg/mL），選取衍生溫度（A，℃）、衍生時間（B，min）、Dns-Cl濃度（C，mg/mL）和pH值（D）4個變量，進行響應面分析（response surface analysis，RSA），響應面因素水平如表1進行設計。

1.3.6 色譜條件

采用上海月旭公司Ultimate XB-C18色譜柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm），二極管陣列檢測器波長254 nm，柱溫35 ℃，進樣量10 μL，流速0.8 mL/min。流動相A為10%乙腈/90%（含0.1%乙酸的0.01 mol/L乙酸銨溶液），流動相B為90%乙腈/10%（含0.1%乙酸的0.01 mol/L乙酸銨溶液）。梯度洗脫程序[29]見表2。

表1 響應面實驗因素水平

表2 梯度洗脫程序

2 結(jié)果與分析

2.1 柱前衍生條件的優(yōu)化

2.1.1 衍生反應的單因素實驗

Dns-Cl是生物胺衍生化反應中常見的衍生試劑，微溶于水，其衍生物化學性質(zhì)穩(wěn)定。因此，本實驗選擇以Dns-Cl為衍生試劑。由圖1可知，以5%TCA作為提取溶劑時，8種BAs均可被檢測且所對應的響應值最大；Dns-Cl質(zhì)量濃度為7 mg/mL時，峰面積響應值迅速增強（組胺除外），隨后增長緩慢，分析其原因可能是隨著Dns-Cl質(zhì)量濃度增大，衍生反應更充分；pH=9時響應值為最大值，pH＞9時，8種生物胺響應值均不同程度減少直至趨于平緩，這與文獻[26]的研究結(jié)論一致，即pH過高會導致二胺和多胺產(chǎn)生非目標衍生物；衍生溫度40 ℃時響應值達到最大，除腐胺和亞精胺外，其余生物胺衍生物峰面積響應值均呈先增加后減少趨勢。李冉冉等[2]和劉景等[30]研究也表明：適當?shù)纳郎貢寡苌锂a(chǎn)量增加，但溫度過高則會造成衍生物產(chǎn)量減少；衍生時間為40 min時響應值達到最大值，且隨衍生時間增加響應值減小。

因此實驗選擇以5% TCA作為提取溶劑，衍生劑質(zhì)量濃度范圍為10～15 mg/mL，衍生pH范圍為8～10，衍生溫度范圍為20～60 ℃，衍生時間范圍為30～50 min。

2.1.2 響應面分析法優(yōu)化衍生反應

2.1.2.1 響應面實驗的結(jié)果

結(jié)合單因素實驗結(jié)果，依據(jù)Box-Behnken中心組和實驗設計原理，響應面實驗結(jié)果如表3所示。

2.1.2.2 方差顯著性分析

依據(jù)Box-Behnken中心組和實驗設計原理，獲得回歸方程并進行方差分析，結(jié)果見表4。

術(shù)中導絲斷裂分析其主要原因是操作技術(shù)不當，置入椎弓根螺釘時出現(xiàn)與導絲成角，螺釘旋入過程將導絲截斷，其次是導絲反復使用。

由表4知，因素B、D、AC、A2、B2、C2、D2對8種生物胺濃度響應值影響極顯著（P＜0.001）。其中AC在8種BAs衍生過程中存在協(xié)同增效作用。由F值可知，5種因素對生物胺濃度響應值的影響程度為：衍生時間＞衍生體系pH值＞衍生溫度＞衍生劑質(zhì)量濃度，且衍生溫度和衍生劑濃度AC具有強的交互作用。劉景等[30]利用響應面法分析干酪中的組胺衍生條件發(fā)現(xiàn)4種因素影響程度大小為：衍生劑質(zhì)量濃度＞衍生時間＞衍生體系pH值＞衍生溫度，與本實驗結(jié)果不一致。其原因可能是本實驗同時探討了8種生物胺的衍生條件，因此需考慮8種生物胺的影響而不是單一考慮組胺。

由表4可知，實驗所選回歸模型的P＜0.000 1，表明回歸模型對8種生物胺濃度的響應值極顯著；失擬項P=0.256 3＞0.05，表明模型選擇合理、可靠；相關(guān)系數(shù)R2為0.983 8，表明生物胺濃度響應值的實際值與預測值之間具有很好的擬合關(guān)系；變異系數(shù)C.V較小，表明該實驗精確度良好，實驗具有可靠性。因此，該方程能較好地描述各因子與生物胺濃度響應值之間的真實關(guān)系。

2.1.2.3 響應面分析

通過方差分析對具有顯著交互作用因素的等高線和響應面圖進行分析，可直觀、深入地探討相關(guān)變量之間交互作用的影響，找到最佳交互點。等高線形狀能反映任意2個因素間交互作用的強度，其中橢圓形和馬鞍形表示交互作用顯著，圓形則表示相互作用不顯著[31]。響應面和等高線分析結(jié)果如圖2、圖3所示。

圖1 各單因素對生物胺總面積的影響

由圖2和圖3可知，衍生溫度與其他3個因素兩兩交互作用顯著，衍生時間和衍生體系pH值交互作用顯著。綜上，模擬得到8種生物胺的最佳衍生條件為：Dns-Cl質(zhì)量濃度為12.45 mg/mL，衍生體系pH=8.93，衍生溫度為41.35 ℃，衍生時間為37.95 min，所預測的8種生物胺質(zhì)量濃度響應值為2.377 1 mg/mL?？紤]實際情況，最終確定Dns-Cl質(zhì)量濃度為11 mg/mL，衍生體系pH=9，衍生溫度為41 ℃，衍生時間為38 min。在此條件下進行3次實驗，得到的質(zhì)量濃度響應值平均值為2.295 5 mg/mL。實驗值與預測值吻合率達到103.5%，驗證了模型的準確性。

2.2 方法建立及其驗證

2.2.1 標準曲線、檢出限和定量限

按1.3.1配制各濃度梯度的混合標準溶液進行線性試驗，每個質(zhì)量濃度3次平行。按照上述響應面法優(yōu)化獲得的最佳條件（Dns-Cl濃度為11 mg/mL，衍生體系pH=9，衍生溫度為41 ℃，衍生時間為38 min）進行衍生，并按照1.3.6色譜條件進行定量分析。以3倍信噪比為檢出限確定標準，以10倍信噪比為定量限確定標準。8種BAs的線性試驗結(jié)果見表5。

表3 響應面分析實驗結(jié)果

2.2.2 精密度實驗

配制1.000 mg/mL生物胺混合標準溶液，按照最佳衍生條件進行處理，按照1.3.6色譜條件進行定量分析。在同一天內(nèi)和連續(xù)三天內(nèi)分別測定日內(nèi)精密度和日間精密度，每個樣品連續(xù)測定6次。精密度測定結(jié)果見表6。

由表6可知，混合標準溶液的日內(nèi)精密度和日間精密度分別在1.01%～3.76% 和3.31%～4.92% 范圍內(nèi)，精密度良好。

表4 生物胺濃度響應值的回歸方程方差分析

2.2.3 加標回收率實驗

在線性范圍內(nèi)選取50、100和200 mg/L 3個濃度水平進行加標回收率實驗，按照最佳衍生條件進行處理，按照1.3.6色譜條件進行定量分析，每個加標樣品平行測定3次。加標回收率實驗結(jié)果見表7。

由表7可知，3個加標水平下8種生物胺的平均回收率在90.44%～109.29%。相對標準偏差在1.02%～2.54%。說明此法準確性高，可用于郫縣豆瓣中生物胺的定性定量分析。

2.3 郫縣豆瓣中BAs測定

2.3.1 標準樣品和實際樣品的圖譜

圖2 各因素交互作用對生物胺響應值的響應面圖

以5%TCA為提取溶劑，衍生時間為38 min、衍生溫度為41 ℃、反應體系pH值為9、Dns-Cl質(zhì)量濃度為11 mg/mL條件下進行分析，得到標準品和郫縣豆瓣中BAs的HPLC圖譜，見圖4。由圖4可知，8種BAs在40 min內(nèi)均被完全洗脫出來，各BAs分離度好且峰型對稱，雜峰干擾少，由此說明本方法適用于郫縣豆瓣中BAs的分析。

2.3.2 3個發(fā)酵年份郫縣豆瓣樣品中BAs的種類和含量

由表8可知，在3個不同發(fā)酵年份的豆瓣中檢測出6種生物胺，其中β-苯乙胺含量最高為19.15±0.21 mg/kg，酪胺、腐胺、亞精胺的含量較高，依次為8.60±0.16、7.28±0.12、4.43±0.07 mg/kg，組胺和尸胺未檢出。這與Byun等[32]的研究結(jié)論相符，其研究也表明中國市場的豆瓣生物胺含量依次為β-苯乙胺＞腐胺＞酪胺＞亞精胺＞精胺。此實驗結(jié)果與文獻[32]不同的是酪胺含量高于腐胺含量，其原因可能是郫縣豆瓣采用自然的發(fā)酵工藝以及制備豆瓣原料的不同而造成的差異性。

豆瓣樣本中生物胺總量范圍在16.77±0.32 mg/kg～34.69±0.65 mg/kg，其范圍均低于陳功等[25]報道的37.86±6.69 mg/kg～158.11±8.53 mg/kg。究其原因，可能是樣品來源的發(fā)酵環(huán)境和時間跨度不同，以及蠶豆瓣作為郫縣豆瓣原料的一部分，其含量相對較少，最終BAs含量并不會很高。實驗結(jié)果表明，3個發(fā)酵年份的BAs總量大小依次為B（發(fā)酵1.5年）＞C（發(fā)酵2.5年）＞A（發(fā)酵0.5年），說明發(fā)酵時間影響郫縣豆瓣中BAs的形成。推測該現(xiàn)象發(fā)生的原因可能是：在發(fā)酵初期階段，隨著發(fā)酵時間的延長，蛋白質(zhì)逐漸分解形成氨基酸，在微生物脫羧作用下BAs總量含量逐漸增加。當發(fā)酵至一定時間，發(fā)酵豆瓣中的葡萄糖和乳酸等營養(yǎng)物質(zhì)不斷消耗殆盡時，BAs會發(fā)揮促進細胞代謝和生長等活性作用。在后期發(fā)酵過程中，BAs作為氮源進行生物轉(zhuǎn)化、降解，例如腐胺、精胺亞和精胺等。當BAs的降解速度大于其合成速度，就導致其在豆瓣發(fā)酵后期的總量降低。另有研究[5]表明，可能由于在發(fā)酵后期微生物群落演替發(fā)生變化，主要是含氨基酸脫羧酶的微生物種群比例發(fā)生變化，微生物的生物胺氧化酶大量表達抑制其氨基酸脫羧酶的產(chǎn)生；因此，導致隨著發(fā)酵時間的延長，豆瓣中BAs總量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。

圖3 各因素交互作用對生物胺響應值的等高線圖

表5 線性實驗結(jié)果

目前，國內(nèi)外對個別魚類產(chǎn)品中的生物胺[33-34]，以及對食品中毒性較強的組胺和酪胺進行了限量規(guī)定并提出了合理建議，但對腐胺、精胺等少有制定相應的法規(guī)[35]。有研究者認為，通用食品中組胺、酪胺和苯乙胺的毒性閾值分別為：100、100～800、30 mg/kg[10]，這遠高于郫縣豆瓣樣品中的組胺、酪胺和苯乙胺的含量，證明此實驗所使用郫縣豆瓣安全性良好。食品限量標準的制定存在不合理性，即對新鮮食品與發(fā)酵食品分別形成的BAs特點及其食品組分、食用頻率等的差異性未加考慮。另外，郫縣豆瓣僅作為調(diào)味品參與居民飲食，平均每日攝入生物胺的量都遠遠低于普通食品中限定標準，但考慮生物胺總量應該是來自不同食物中所有胺的總和；因此，測定豆瓣中生物胺的含量具有必要性。且郫縣豆瓣采用的自然發(fā)酵工藝以及原料具有高蛋白質(zhì)的特殊性，可能會造成其氨基態(tài)氮增加，最終導致BAs含量超標；因此，建立有效的高靈敏檢測郫縣豆瓣中的生物胺的方法對控制食品中生物胺的含量具有重要意義。

表6 精密度實驗結(jié)果（n=6）

表7 加標回收率實驗結(jié)果（n=3）

3 結(jié)論

本文建立的柱前衍生-HPLC法可同時測定郫縣豆瓣中的組胺、酪胺、尸胺、腐胺、苯乙胺、色胺、精胺和亞精胺。利用此法對3個不同發(fā)酵年份的某郫縣豆瓣進行檢測分析得出，酪胺、腐胺和亞精胺是郫縣豆瓣中的主要BAs，BAs總量范圍在16.77±0.32～34.69±0.65 mg/kg。目前，國內(nèi)外并未制定針對郫縣豆瓣等傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品中BAs的限量標準。由于郫縣豆瓣中BAs的種類和含量受原料、發(fā)酵環(huán)境、溫度、pH值抑制氨基酸脫羧酶生成的微生物諸多因素的影響，會造成在生產(chǎn)和儲存中任意環(huán)節(jié)BAs的積累。因此，郫縣豆瓣中BAs含量的安全檢測評估不僅可以科學認識傳統(tǒng)發(fā)酵工藝安全性問題，而且對優(yōu)質(zhì)郫縣豆瓣走向世界也有較大的推進作用。另外，本實驗結(jié)果可為相關(guān)標準的制定提供一定的理論依據(jù)。

圖4 標準品和郫縣豆瓣樣品中BAs衍生物HPLC色譜圖

表8 郫縣豆瓣中生物胺的含量（n=3） mg/kg