張 燕，李 麗，馮席汶，劉 銘，孫 楊

（西華大學理學院，四川 成都 610039）

蛋白質硝化主要是指蛋白質中的酪氨酸硝化成3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine,3-NT)，是一種重要的蛋白質翻譯后修飾。脂質過氧化是體內氧應激增強后發(fā)生的活性氧（reactive oxygen species,ROS）氧化生物膜的過程。許多生理和病理狀態(tài)下都能檢測到3-NT的存在以及脂質過氧化的相關產物，多種疾病如心血管疾病、神經退行性疾病、糖尿病等的發(fā)生發(fā)展與它們密切相關[1-6]。

相關研究表明，某些因素如pH值、催化劑等也會影響蛋白質硝化和脂質過氧化。Herold等[7]發(fā)現(xiàn)在氧化肌紅蛋白存在的情況下，酪氨酸硝化在酸性溶液介質中更能有效地進行。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)不同形態(tài)的鐵催化蛋白硝酸也有所差異[8]?？梢姡芤旱乃釅A性、催化劑等多種因素會影響蛋白質酪氨酸硝化和脂質過氧化。

緩沖溶液對維持生物的正常pH值和正常生理環(huán)境起到重要作用。人體血液中以H2CO3-HCO3-在血液中濃度最高，緩沖能力最大，對維持血液正常的pH值起主要作用。Tris堿的堿性強，可以只用這一種物質配制pH范圍由酸性到堿性的大范圍pH值的緩沖液，加之Tris緩沖液對生物化學過程干擾很小；因此，該緩沖液目前在生物化學研究中使用得越來越多。磷酸鹽緩沖液因其寬的pH范圍以及受溫度影響小的特點而成為生物化學研究中使用最廣泛的一種緩沖劑。Hepes緩沖能力較強，pKa值為7.55，幾乎不受外界因素影響，并且不易形成緩沖劑-金屬離子復合物，也是一種廣泛應用的緩沖劑。但相關研究[9]表明，Hepes具有阻斷陰離子通道、影響培養(yǎng)細胞生長、抑制平滑肌肌力等生物學效應，因此，用Hepes作為緩沖劑時，其生物學效應不可忽視。檸檬酸鹽緩沖液主要成分為檸檬酸和磷酸氫鈉，常用于免疫分析。

本文選擇5種常用緩沖溶液（碳酸鹽緩沖溶液、Tris-HCl緩沖溶液、磷酸緩沖溶液、檸檬酸緩沖溶液、Hepes緩沖溶液）來研究緩沖溶液對2種不同形態(tài)鐵（EDTA-Fe(Ⅲ)和檸檬酸鐵）催化H2O2-NO2-導致BSA蛋白硝化和脂質過氧化的影響，以此來探討影響蛋白質硝化和脂質過氧化的因素。

1 材料與方法

1.1 試劑

牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA），亞硝酸鈉（sodium nitrite,NaNO2），雙氧水（hydrogen peroxide,H2O2），檸檬酸鐵，EDTA-Fe(Ⅲ)，磷酸鹽（phosphoric acid,PBS），鹽酸萘乙二胺，三氯乙酸（trichloroacetic acid,TCA），硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid,TBA），正丁醇（n-butanol），碳酸鈉，Tris-Base，磷酸鈉，檸檬酸，Hepes(2-［4-(2-hydroxyethyl) piperazinyl］ethanesulfonic acid)。

1.2 硝基酪氨酸含量的測定

在pH ＞ 9.5的條件下，3-NT在430 nm處有最大吸收，因此可以依據(jù)吸收光譜來計算其濃度。具體操作如下：取1 mL 10 mg·mL-1的BSA置于10 mL容量瓶中，然后分別加入100 μL 4 mmol·L-1的EDTA（或檸檬酸鐵）、100 μL 0.1 mol·L-1NaNO2、100 μL 0.1 mol·L-1H2O2，最后用不同緩沖溶液補充至刻度，搖勻。將容量瓶置于37 ℃恒溫水浴鍋中水浴 30 min，然后取4.0 mL反應液，加入400 μL 1 mol·L-1的NaOH溶液，搖勻后在430 nm處測定吸光度。

1.3 亞硝酸鹽含量的測定

酸性條件下，亞硝酸鹽與磺胺作用生成重氮化合物，再與N-1-奈基乙二胺鹽酸進行偶聯(lián)反應，生成紫紅色化合物，該化合物在550 nm處有最大吸收峰，可通過分光光度法比色測得[10]。具體步驟：取1.2中所述反應液3 mL，然后加入3 mL Griess試劑，混勻后常溫反應15 min，然后在550 nm處測定其吸光度值，同時做NaNO2標準曲線。

1.4 脂質過氧化反應的測定

當生物膜中的多不飽和脂肪酸受到氧自由基的攻擊就會引發(fā)脂質過氧化作用，由此形成脂質過氧化產物，如醛基（丙二醛，MDA）、氫過氧基等。丙二醛（MDA）是脂質過氧化的一個重要檢測指標，而以硫代巴比妥酸（TBA）方法測得的MDA含量已被廣泛用作診斷組織傷害和脂質過氧化程度的指標。丙二醛可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產物（thiobarbituric acid reactive substances,TBARS），該化合物在532 nm處有最大吸收峰，由此可推算出脂質過氧化的程度[11]。取1.2中所述反應液2 mL，分別加入2 mL 20%三氯乙酸，5.0 mL 0.6%硫代巴比妥酸。沸水浴中反應1 h，流水冷卻后，加入8 mL正丁醇，迅速用力上下晃動30 s，靜置片刻，7 000 r/min離心5 min后取上層澄清溶液，在532 nm處測定其吸光度值。

1.5 統(tǒng)計方法

試驗結果顯著性差異分析采用組間t檢驗法。當P＜0.05時，則認為2組數(shù)據(jù)有顯著性差異；當P＜0.01 時,則認為2組數(shù)據(jù)有極顯著性差異。

2 實驗結果

2.1 不同緩沖溶液中硝基酪氨酸含量的比較

圖1 不同緩沖溶液對BSA硝基酪氨酸濃度的影響

3-NT比較穩(wěn)定，所以它可以作為檢測細胞和組織損傷的一個生物標志[12-13]。不同緩沖溶液中，F(xiàn)e(Ⅲ)-H2O2-NO2-對BSA硝基酪氨酸濃度的影響如圖1及表1所示。從圖1(a)及表1中可以看出，EDTA-Fe(Ⅲ)-H2O2-NO2-體系下，碳酸鹽緩沖溶液中硝基酪氨酸含濃度最高，可達23.6 μmol·L-1，Tris-HCl緩沖溶液中硝基酪氨酸的濃度最小，僅為8.7 μmol·L-1；5種緩沖溶液中硝基酪氨酸濃度順序為碳酸鹽 ＞ Hepes ＞ 磷酸鹽 ＞ 檸檬酸 ＞ Tris-HCl。從圖1(b)及表1中可以看出，在檸檬酸鐵-H2O2-NO2-體系下，碳酸鹽緩沖溶液中硝基酪氨酸濃度最高，可達10.3 μmol·L-1；Hepes緩沖溶液中硝基酪氨酸濃度最低，僅為7.1 μmol·L-1。5種緩沖溶液中硝基酪氨酸濃度順序為：碳酸鹽 ＞ 磷酸鹽 ＞ Tris-HCl ＞檸檬酸 ＞ Hepes。

表1 不同緩沖溶液中硝基酪氨酸的濃度

此外，我們發(fā)現(xiàn)，無論是在EDTA-Fe(III)還是檸檬酸鐵催化H2O2-NO2-體系中，磷酸鹽緩沖溶液中的硝基酪氨酸濃度都是最高的。另外，無論在哪種緩沖體系中，EDTA-Fe(Ⅲ)-H2O2-NO2-體系催化BSA發(fā)生蛋白硝化的能力均大于檸檬酸鐵-H2O2-NO2-體系。

2.2 不同緩沖溶液中亞硝酸鹽質量分數(shù)的比較

在生物體內，亞硝酸鹽可被氧化成活性氮[14-15]，因此可通過測定其質量分數(shù)的降低值來反映氧化量。Fe(III)-H2O2-NO2-體系在不同緩沖溶液中亞硝酸鹽質量分數(shù)如圖2及表2所示。由圖2可知，無論是在EDTA-Fe(III)還是檸檬酸鐵催化H2O2-NO2-體系中，所有緩沖溶液中亞硝酸鹽的質量分數(shù)均有所降低，且質量分數(shù)順序均為：檸檬酸＞Tris-HCl＞碳酸鹽＞Hepes＞磷酸鹽。其中，在EDTAFe(III)催化H2O2-NO2-體系中，Hepes緩沖溶液及磷酸鹽緩沖溶液中亞硝酸鹽質量分數(shù)均較空白降低18%左右；在檸檬酸鐵催化H2O2-NO2-體系中，Hepes緩沖溶液及磷酸鹽緩沖溶液中亞硝酸鹽質量分數(shù)也較空白組降低13%左右。實驗結果說明，F(xiàn)e(III)-H2O2-NO2-體系在這2種緩沖溶液中，亞硝酸鹽最易被氧化。

2.3 不同緩沖溶液中脂質過氧化反應的比較

圖2 不同緩沖溶液中亞硝酸鹽質量分數(shù)的比較

表2 不同緩沖溶液中亞硝酸鹽的質量分數(shù)

Fe(III)-H2O2-NO2-體系中，不同緩沖溶液對BSA脂質過氧化產物TBARS的影響如圖3及表3所示。實驗結果表明，無論是EDTA-Fe(III)-H2O2-NO2-體系還是檸檬酸鐵-H2O2-NO2-體系，BSA在Tris-HCl緩沖溶液中發(fā)生脂質過氧化程度都最高，其脂質過氧化產物TBARS濃度可達2.2 μmol·L-1，檸檬酸緩沖溶液中最低，TBARS濃度僅為0.6 μmol·L-1。這 說 明，在Fe(III)-H2O2-NO2-體系中，BAS置于Tris-HCl緩沖溶液最易發(fā)生脂質過氧化。五種不同緩沖溶液中，BSA發(fā)生脂質過氧化程度順序為：Tris-HCl ＞ 碳酸鹽 ＞ 磷酸鹽 ＞ Hepes ＞檸檬酸。這表明，緩沖溶液對BSA的脂質過氧化將產生一定的影響。

圖3 不同緩沖溶液對BSA脂質過氧化產物TBARS的影響

表3 不同緩沖溶液中脂質過氧化產物TBARS的濃度

3 討論

蛋白質硝化和脂質過氧化的程度會因一些外部因素如緩沖溶液、pH值、催化劑等的影響而有所差異[7-8,16]。為了進一步研究緩沖溶液對蛋白質硝化、脂質過氧化的影響，本文選用了碳酸鹽、Tris-HCl、磷酸鹽、檸檬酸、Hepes 5種常用的緩沖溶液，以Fe(III)-H2O2-NO2-體系造成BSA酪氨酸硝化及脂質過氧化，以此來探究緩沖溶液對蛋白質硝化和脂質過氧化的影響。

實驗結果表明，EDTA-Fe(III)和檸檬酸鐵均能有效地催化H2O2-NO2-體系導致BSA發(fā)生酪氨酸硝化和脂質過氧化，但在不同的緩沖溶液中，酪氨酸硝化及脂質過氧化的程度有所不同。對于蛋白質硝化，兩種催化體系下，Na2CO3緩沖溶液的硝化程度都最高，這說明一定濃度的碳酸鹽可能有助于蛋白質硝化的形成。其原因可能是因為CO32-在生理pH值下，能迅速的氧化雙硫磷、DNA、RNA鳥嘌呤殘基、金屬蛋白和蛋白質殘基，特別是色氨酸、半胱氨酸、酪氨酸，使得它們產生相應的基團[17-18]。對于脂質過氧化，無論在EDTA-Fe(III)催化作用下還是在檸檬酸鐵催化作用下，5種緩沖溶液中BSA發(fā)生脂質過氧化程度順序為：Tris-HCl ＞碳酸鹽 ＞ 磷酸鹽 ＞ Hepes ＞ 檸檬酸。在同一緩沖液中，EDTA-Fe(III)和檸檬酸鐵催化BSA發(fā)生酪氨酸硝化和脂質過氧化程度也有所差異，這表明緩沖體系以及催化劑的選擇對蛋白質硝化、脂質過氧化會產生很大程度的影響。

本文對影響蛋白質硝化、脂質過氧化的因素只做了初步研究，實驗結果可為進行細胞或其他體外氧化實驗提供一定的理論依據(jù)，但體內發(fā)生蛋白質硝化、脂質過氧化的環(huán)境是復雜的；因此，對影響蛋白質硝化、脂質過氧化的因素還有待進一步深入研究。