曹冠華 ，張 雪，陳 迪，李 莉，張兆傳，顧 雯，王希付，賀 森*

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南 昆明 650500；2.云南大學(xué)，云南省生物資源開發(fā)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650591；3.道地藥材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，北京 100700）

三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen，又名田七、參三七，為五加科人參屬多年生草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中草藥，主要以根部入藥，具有止血、散瘀、消腫、定痛等功效，可用于治療心腦血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)等疾病［1-2］。

近年來調(diào)查顯示，三七藥材砷、鉛超標(biāo)問題嚴(yán)重，且主要污染途徑為土壤污染。閻秀蘭［3］、張文斌等［4］對(duì)文山州及外延區(qū)三七主要種植地土壤樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)總砷質(zhì)量濃度分別為6.9～242.0、8.38～81.34 mg/kg，遠(yuǎn)超土壤三級(jí)標(biāo)準(zhǔn)As 要求（≤30 mg/kg）；祖艷群等［5］調(diào)查發(fā)現(xiàn)，文山主要三七種植區(qū)中土壤Pb 含有量平均為55.56%，超標(biāo)率為6.67%。三七重金屬超標(biāo)已成為三七種植業(yè)急需解決的問題之一。

植物內(nèi)生真菌在促進(jìn)宿主生長(zhǎng)、增強(qiáng)脅迫抗性等方面發(fā)揮著重要作用［6-8］。內(nèi)生真菌主要包括不可純培養(yǎng)的叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）和可純培養(yǎng)的深色有隔內(nèi)生真菌（dark septate endophytes，DSE）兩大類。目前對(duì)三七內(nèi)生真菌功能的研究較少，張玉潔等［9］對(duì)108 株三七內(nèi)生真菌進(jìn)行病原菌抑菌效果測(cè)試，篩選得到14 株效果菌；劉凱［10］、楊芳芳［11］對(duì)三七源內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物及抗菌活性進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)分離自三七根27 株內(nèi)生真菌行重金屬（As、Pb）耐性評(píng)價(jià)，并采用分子手段對(duì)功能菌株進(jìn)行分類學(xué)地位鑒定，以期為三七種植As、Pb 污染的生態(tài)治理提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用菌株為實(shí)驗(yàn)室前期分離自3 年生健康三七須根內(nèi)生真菌，共27 株，編號(hào)Pn-1～Pn-27。

2 方法

2.1 菌株重金屬耐性評(píng)價(jià)

2.1.1 耐性菌株初篩 將27 株處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的三七內(nèi)生真菌，用打孔器沿菌落外緣部位打孔取樣，取4 片分別接種至終質(zhì)量濃度為400 mg/L As5+或200 mg/L Pb2+MMN培養(yǎng)基［葡萄糖15 g、MgSO40.15 g、NaCl 0.025 g、CaCl20.05 g、1% FeCl31.2 mL、KH2PO40.5 g、（NH4）2HPO40.25 g、Vitamin B1 100 μg，加純凈水至1 000 mL，調(diào)整pH至5.8，121 ℃、20 min 高溫高壓滅菌］中；30 ℃，120 r/min搖床培養(yǎng)7 d；抽濾，0.01% EDTA 清洗3～4 次，純凈水沖洗5～6 次；45 ℃烘干，稱定質(zhì)量［12-13］。

2.1.2 目標(biāo)菌株重金屬耐性評(píng)價(jià) 設(shè)置砷質(zhì)量濃度梯度為0、200、400、800、1 600 mg/L；鉛質(zhì)量濃度梯度為0、100、200、400、800 mg/L；按上述接種方式進(jìn)行接種和處理，稱定菌絲干重，并測(cè)定菌絲重金屬含有量。

2.1.3 砷測(cè)定 采用氫化物發(fā)生原子熒光光譜法進(jìn)行測(cè)定，具體參考《食品中總砷及無機(jī)砷的測(cè)定》（GB 5009.11—2014），得回歸方程Y＝283.24X+36.966（r＝0.997 7）。

2.1.4 鉛測(cè)定 采用火焰原子吸收法進(jìn)行測(cè)定，具體參考《食品中鉛的測(cè)定》（GB 5009.12—2017），得回歸方程Y＝0.02X-0.001 7（r＝0.997 6）。

2.2 菌株分子鑒定 采用真菌通用引物對(duì)核糖體18 s 進(jìn)行擴(kuò)增，引物為3NDF，5′-GGCAAGTCTGGTGCCAG-′；V4R，5′-ACGGTATCTAGATCAGTCTTCG-3′。菌株DNA 的提取參考天根基因組DNA 提取試劑盒（貨號(hào)DP302-02）說明書；PCR 擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性，94 ℃4 min；變性94 ℃30 s，退火53 ℃40 s；延伸，72 ℃1 min，35 個(gè)循環(huán)；后延伸，72 ℃7 min；4 ℃保存。PCR 酶為2×Pfu PCR MasterMix（貨號(hào)KP201-02）。PCR 產(chǎn)物測(cè)序由云南濤擎生物科技有限公司完成。采用Mega 4 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.3 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)分析采用軟件SPSS 21.0；當(dāng)因子≥3，采用單因素方差分析中的Turkey HSD 檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析；當(dāng)分析2 個(gè)因子差異時(shí)，采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)。采用軟件Sigmaplot 11.0 進(jìn)行作圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 三七根內(nèi)生真菌重金屬耐性菌株初篩分析 由圖1 可知，內(nèi)生真菌在相同濃度砷或鉛脅迫下，其生物量（菌絲干重）差異較大。在400 mg/L As5+脅迫下，菌株P(guān)n-6、Pn-7、Pn-11、Pn-17 和Pn-18 不能生長(zhǎng)，而菌株P(guān)n-12、Pn-13 和Pn-21 則生長(zhǎng)較好，菌絲干重分別為0.25、0.24、0.24 g（見圖1A）。在200 mg/L Pb2+脅迫下，菌株P(guān)n-2、Pn-4、Pn-10、Pn-11 和Pn-17 不能生長(zhǎng)；菌株P(guān)n-13、Pn-25 和Pn-12 生物量相對(duì)較高，分別為0.27、0.21、0.20 g（見圖1B）。綜合As5+、Pb2+脅迫下內(nèi)生真菌菌絲干重測(cè)定結(jié)果，選擇菌株P(guān)n-12 和Pn-13 進(jìn)行下一步研究。

圖1 不同重金屬處理對(duì)三七根內(nèi)生真菌菌株生長(zhǎng)的影響

3.2 不同重金屬濃度對(duì)耐性菌株生物量及重金屬含有量積累的影響 由圖2 可知，隨著As5+或Pb2+處理濃度的升高，菌株P(guān)n-12、Pn-13 生物量（菌絲干重）逐漸降低。截止As5+濃度達(dá)到800 mg/L，菌株P(guān)n-12 菌絲干重與無重金屬處理比較，無顯著差異，但在1 600 mg/L·As5+處理下，Pn-12 菌絲干重下降明顯，與前4 個(gè)處理濃度比較，差異顯著。菌株P(guān)n-13 菌絲干重則在800 mg/L 脅迫下下降明顯，與前3 個(gè)處理濃度比較，差異顯著，但與1 600 mg/LAs5+無顯著差異。在不同Pb2+脅迫下，菌株P(guān)n-12、Pn-13 菌絲干重變化規(guī)律同As5+脅迫下的變化規(guī)律基本一致，在0～400 mg/L范圍內(nèi)，菌株P(guān)n-12 菌絲干重下降平緩，無顯著差異，但與800 mg/L 比較，差異顯著；而在0～200 mg/L范圍內(nèi)，菌株P(guān)n-13 菌絲干重之間無差異顯著，但與400、800 mg/L 脅迫下菌絲干重比較，呈顯著差異。菌株P(guān)n-12與Pn-13 菌絲干重在高濃度As5+（800、1 600 mg/L）和Pb2+（400 mg/L）脅迫下差異顯著，表明菌株P(guān)n-12 砷、鉛耐性強(qiáng)于Pn-13。

圖2 不同As5+、Pb2+處理濃度對(duì)菌絲干重的影響

由圖3 可知，隨著As5+、Pb2+濃度的增加，菌絲中的重金屬含有量快速增加，且在0～800 mg/L Pb2+或400～1 600 mg/L As5+脅迫下，菌株P(guān)n-12、Pn-13 菌絲重金屬含有量在每?jī)蓾舛戎g差異顯著。在200～1 600 mg/L As5+處理下，菌株P(guān)n-12、Pn-13 菌絲重金屬含有量分別從1.87、2.52 mg/kg 增至33.40、21.62 mg/kg，分別增加了17.86、8.58 倍。由此可知，菌株P(guān)n-12 在砷積累能力方面強(qiáng)于Pn-13，且在1 600 mg/L 處理下呈顯著差異。在100～800 mg/L Pb2+處理下，菌株P(guān)n-12、Pn-13 菌絲重金屬含有量分別從15.47、12.34 mg/kg 增至204.35、112.32 mg/kg，分別增加了13.21、9.10 倍，并看出菌株P(guān)n-12 在Pb 積累能力方面同樣優(yōu)于Pn-13，且在4 個(gè)處理濃度下，均差異顯著?？傮w來看，砷、鉛在菌株P(guān)n-12、Pn-13 菌絲中的積累狀況呈現(xiàn)砷低鉛高現(xiàn)象。

圖3 不同As5+、Pb2+處理濃度對(duì)菌絲重金屬積累的影響

3.3 重金屬耐性菌株分類學(xué)地位鑒定 分別以菌株P(guān)n-12、Pn-13 擴(kuò)增序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)，收集一致性較高的其他物種序列構(gòu)建NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹文本，并以鰻弧菌Vibrio anguillarum作為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，菌株P(guān)n-12與球孢枝孢霉Cladosporium sphaerospermum聚為一枝，同源性100%。菌株P(guān)n-13 與支孢樣支孢霉C.cladosporioid聚為一枝，同源性亦為100%，初步判定菌株P(guān)n-12、Pn-13 分別為球孢枝孢霉C.sphaerospermum、支孢樣支孢霉C.cladosporioid。見圖4。

圖4 基于核糖體18 s 氨基酸序列菌株P(guān)n-12 和Pn-13系統(tǒng)進(jìn)化樹

4 討論

目前對(duì)農(nóng)業(yè)土壤重金屬污染的治理多采用農(nóng)藝措施，如減少含砷農(nóng)藥的使用、規(guī)范化種植、使用土壤改良劑、合理施肥等［14］，而利用綠色、高效、無污染的生物手段治理或緩解土壤重金屬污染則是眾多研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)，尤其是利用與植物關(guān)系密切的內(nèi)生菌［15］。諸多研究發(fā)現(xiàn)，AMF 與宿主植物的重金屬耐性密切相關(guān)，在Cd、Pb 等重金屬脅迫下，接種AMF 至酸漿果、茄子、扁豆根部，可明顯提高宿主抗氧化能力、生物量和產(chǎn)量［16-18］。而DSE 在提高宿主植物重金屬耐性方面同樣發(fā)揮著重要作用，有研究發(fā)現(xiàn)，DSE 可通過將重金屬（Cd）固定在菌絲或須根細(xì)胞內(nèi)，從而提高玉米的重金屬耐性，但DSE 提高宿主重金屬耐性的調(diào)控機(jī)制仍不明確［19-21］。DSE 等根系優(yōu)勢(shì)的共生真菌可以通過分泌小分子有機(jī)酸等多種途徑強(qiáng)化宿主植物的植物鈍化效應(yīng)，從而阻止植物重金屬的吸收和積累［22］；也有部分研究表明，DSE 菌株可通過外排機(jī)制將重金屬離子排出根系，從而提高宿主重金屬耐性［23］。目前尚未見將DSE 應(yīng)用于三七重金屬污染治理的報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)，分離自三七根部的DSE 菌株具有一定的重金屬耐性，部分菌株（Pn-12、Pn-13）對(duì)As5+、Pb2+具有超高耐性，且重金屬在菌絲中的積累存有一定的差異（砷低鉛高），證明菌株P(guān)n-12、Pn-13 對(duì)As5+、Pb2+的耐性機(jī)制不同，推測(cè)菌株P(guān)n-12、Pn-13 主要通過金屬離子外排機(jī)制來提高As 耐性，而通過金屬離子菌絲積累機(jī)制（如將金屬離子絡(luò)合物儲(chǔ)存在液泡中）增強(qiáng)Pb 耐性，但需進(jìn)一步研究明確。待明確其作用機(jī)制后，則可將其制成接種菌劑，回接至三七須根部位，通過形成菌根體系，利用菌株外排或積累作用，從而減輕As、Pb 在三七根部的積累，進(jìn)而保障三七的品質(zhì)質(zhì)量。本研究結(jié)果在解決三七及其他中藥材種植過程中的重金屬污染問題方面具有廣闊的應(yīng)用前景，同時(shí)也可為發(fā)展中藥材生態(tài)種植業(yè)提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

5 結(jié)論

分離自三七根DSE 菌株P(guān)n-12，Pn-13 具有較高的砷、鉛耐性，且菌株P(guān)n-12 砷、鉛耐性強(qiáng)于Pn-13；但二者菌絲中砷、鉛含有量差異較大，存在砷低鉛高的現(xiàn)象，表明菌株P(guān)n-12，Pn-13 對(duì)砷、鉛的耐性機(jī)制存有一定的差異。初步鑒定菌株P(guān)n-12、Pn-13 分別為球孢枝孢霉、支孢樣支孢霉。