袁 星 蔣 斌 曹 雷

合肥職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院 安徽合肥 238000；①合肥市第八人民醫(yī)院檢驗科

大腸埃希菌存在于正常人體的體表和各種腔道，也廣泛分布在醫(yī)院環(huán)境中。該菌雖屬于正常菌群但常造成醫(yī)源性疾病，特別是肺炎、創(chuàng)面感染、泌尿道感染、腦膜炎和菌血癥等[1]。十多年來大腸埃希菌呈現(xiàn)逐年增高的耐藥率變遷趨勢，且已出現(xiàn)多重耐藥株。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrumβ-lac-tamases，ESBLs)是一類能水解青霉素類、一至三代頭孢菌素類及單環(huán)類抗生素，且能被ESBLs抑制劑(如棒酸、舒巴坦等)抑制活性的廣譜ESBLs[2-3]，亦是大腸桿菌對β-內(nèi)酰胺類抗菌素耐藥的主要內(nèi)在機(jī)制。因為ESBLs的基因型較為復(fù)雜多變，各種基因型對抗菌素的敏感性也不盡相同，另外表達(dá)ESBLs的大腸埃希菌流行情況隨著年代、時間和地區(qū)的不同而異，臨床感染治療的效果也就各不相同。因此檢測臨床分離的表達(dá)ESBLs大腸桿菌的耐藥情況和基因型分布，可為臨床規(guī)范使用抗菌素、監(jiān)控院內(nèi)感染和流行病學(xué)方面的追蹤調(diào)查提供較為有價值的參考依據(jù)。本研究收取了2018年本院分離培養(yǎng)出的136 株大腸埃希菌，針對其耐藥譜及ESBLs耐藥基因分析結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源 合肥市第八人民醫(yī)院由各臨床科室2018年1～12月送檢的各種標(biāo)本中分離培養(yǎng)出136 株大腸埃希菌，去除相同患者多次獲取到的相同菌株。編碼為ATCC25922的大腸桿菌作為標(biāo)準(zhǔn)菌株。各種相關(guān)耐藥基因的陽性對照細(xì)菌，包括標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌(TEM26)，均由安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗中心供給。

1.2抗菌藥物及培養(yǎng)基 本研究使用抗生素有：環(huán)丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LVX)、頭孢哌酮/舒巴坦(CSL/SCF)、氨曲南(ATM)、頭孢曲松 (CRO)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢他啶(CAZ)、氨芐西林/舒巴坦(AMP/SCF)、頭孢唑啉(CZO)、頭孢吡肟(FEP)、頭孢西丁(FOX)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、美羅培南(MEM)、亞胺培南(IMP)、阿米卡星(AMK)、妥布霉素(TOB)、慶大霉素(GEN)、呋喃妥因(NIT/FT)、復(fù)方新諾明(SXT)，以上藥敏紙片和水解酪蛋白瓊脂( Mueller-Hinton Agar ，MH)平板均購于杭州濱和微生物制品公司，藥片批號20170930～20180819。

1.3細(xì)菌鑒定及產(chǎn)酶株確認(rèn) 依據(jù)衛(wèi)健委《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第4版的分離程序鑒定細(xì)菌[4]，鑒定應(yīng)用的全自動微生物分析儀為法國梅里埃生物公司的VITEK-2；采用藥敏紙片增強(qiáng)法行產(chǎn)酶表型確證，即棒酸若能促使CAZ及CTX紙片中任一種的抑菌圈直徑增大超過0.5厘米，即可確認(rèn)為產(chǎn)ESBLs菌株[5]。

1.4藥敏試驗 細(xì)菌對抗生素的體外敏感試驗使用K-B 紙片瓊脂擴(kuò)散法，結(jié)果判別依據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSL/2013版)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[5]，藥敏結(jié)果分析使用由WHO細(xì)菌耐藥監(jiān)測中心推薦的Whonet-5.6軟件。

1.5PCR反應(yīng)和電泳所用試劑TaqDNA聚合酶，各堿基核苷混合物dNTP Mixture，10×PCR Buffer，DNA Marker，6×Loading Buffer，雙蒸水等產(chǎn)品均從大連寶生物公司購置。本實驗室自備了Tris Acetate-EDTA buffer (TAE)緩沖液。

1.6PCR引物 參考Genbank業(yè)已公布的數(shù)據(jù)庫信息，由上海生工生物工程公司設(shè)計并合成各相關(guān)耐藥基因引物序列，見表1。

表1 PCR檢測基因引物序列和目的產(chǎn)物長度

1.7細(xì)菌模板DNA的制備 提前配制好濃度為200g/L的蛋白酶K溶液400L置于專用微量離心管中，挑取約3～5個菌落加入其中并混勻，先用56℃溫育2小時，再置95℃煮浴10分鐘，然后用相對離心力(RCF)為1000～1200克即約13000r/min離心2分鐘，最后將上清液置于-20℃。

1.8細(xì)菌基因檢測 利用一系列信息，采用基因PCR擴(kuò)增的方法檢測各產(chǎn)ESBLs菌株耐藥基因 ，如CTX-M、TEM、SHV和OXA等基因。采用50L PCR體系對各種基因進(jìn)行反應(yīng)，試劑有：模板3L，10×buffer(Mg2+plus)5L，rTaq酶(5mU/L)0.25L，dNTP Mixture(各2.5mM)4L，引物1(20mM)1L，引物2(20mM)1L，加雙蒸水35.75L，合計50L。循環(huán)擴(kuò)增CTX-M1基因的參數(shù)為：93℃預(yù)變性2分鐘，93℃解鏈45sec，55℃退火45sec，72℃延伸60sec，循環(huán)35個周期，72℃保溫5分鐘；其他基因按照產(chǎn)物片段長短等因素對循環(huán)擴(kuò)增的參數(shù)適當(dāng)變更。產(chǎn)物凝膠電泳使用1.5%瓊脂糖，觀察結(jié)果用凝膠成像分析儀，出現(xiàn)的目標(biāo)條帶若與陽性對照分子位置相當(dāng)則為陽性。調(diào)整電腦的Bio-Rad GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)，將其設(shè)置至最好狀態(tài)，再拍照、存檔。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 采用統(tǒng)計學(xué)分析SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料以例(%)表示，組間率的比較用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1大腸埃希菌對抗生素耐藥表型分析與比較 2018年從臨床標(biāo)本中一共檢出136株大腸埃希菌，其中81株為產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌，占比為59.6%。藥敏結(jié)果顯示大腸埃希菌對青霉素、頭孢菌素類、單環(huán)酰胺類和其他抗菌藥物的耐藥性較高，尤其是產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌；產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對AMP、CZO、CTX、CRO、FEP和ATM的耐藥率均達(dá)到了90%以上；對CAZ、SXT、LVX和CIP的耐藥率也較高，均大于70%；產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌株對MEM、IMP、NIT/FT、AMK、TZP和CSL/SCF的耐藥率較低，各為0.0%、1.2%、9.9%、11.1%、12.3%和13.6%。大腸埃希菌對常用抗菌藥物耐藥率分析與比較,見表2。

表2 136株大腸埃希菌對常用抗生素的藥敏試驗結(jié)果及產(chǎn)酶與否菌株耐藥性比較

2.2耐藥基因PCR擴(kuò)增結(jié)果 81株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌通過 PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)，57株菌獲得了CTX-M基因產(chǎn)物，占比達(dá)70.4%(57/81)，且36株菌獲得466bpCTX-M9基因產(chǎn)物，達(dá)到了44.4%(36/81)；20株菌獲得了1075bp TEM基因產(chǎn)物，陽性率達(dá)24.7%(20/81)；其余4株菌(4.9%，4/81) 獲得了混合型的基因產(chǎn)物；但未檢出SHV和OXA型菌株的基因產(chǎn)物，大腸埃希菌相關(guān)耐藥基因產(chǎn)物電泳圖見圖1、圖2，基因型分析見表3。

圖1 產(chǎn)ESBLs基因CTX-M1和CTX-M8的PCR檢測產(chǎn)物

圖2 產(chǎn)ESBLs基因CTX-M9和TEM的PCR檢測產(chǎn)物

表3 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌基因型構(gòu)成比

3 討論

大腸埃希菌感染率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，已引起微生物學(xué)工作者和臨床醫(yī)生的高度關(guān)注。本研究于2018年1～12月的臨床標(biāo)本中共檢出大腸埃希菌136株，其中有81株為產(chǎn)ESBLs菌株，占比為59.6%，參照過去數(shù)據(jù)表明近年來產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌檢出率有一定程度的升高。按患者所屬的科室大體分布為重癥監(jiān)護(hù)病房、泌尿科和康復(fù)科，其原因可能有患者存在基礎(chǔ)疾病較重、年齡大、住院時間長、免疫力較低、抗生素過度使用等情況。

β-內(nèi)酰胺類抗生素是當(dāng)前臨床上最常使用的抗生素之一，然而，這類藥物在臨床上大量、廣泛應(yīng)用之后，細(xì)菌對其耐藥狀況亦日趨嚴(yán)重。中國醫(yī)院細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)資料顯示，大腸桿菌對頭孢菌素類藥物耐藥率均較高[6]。大腸埃希菌的耐藥率與區(qū)域性、地方性和不同醫(yī)院有關(guān)，本院該菌對青霉素、頭孢菌素、ATM、SXT、氨基糖苷和氟喹諾酮類藥物的耐藥率較高，而對碳青酶烯類、NIT/FT、AMK和含酶抑制劑的復(fù)合藥物耐藥率較低，例如對MEM則全部敏感。結(jié)果還顯示， ESBLs陽性細(xì)菌對頭孢類和其他常用抗生素的耐藥率普遍大于ESBLs陰性細(xì)菌，兩相比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；而這兩類細(xì)菌對于MEM、IMP、NIT/FT、GEN和TOB來說，耐藥率雖有高低之分，差別卻沒有統(tǒng)計學(xué)意義，說明細(xì)菌耐藥率的變遷是一個從量變到質(zhì)變，逐漸積累才形成較為明顯變化的過程。

產(chǎn)ESBLs是大腸桿菌對β-內(nèi)酰胺類抗菌素耐藥的決定性機(jī)制。其中耐藥基因類別較多，比如CTX-M、TEM、SHV和OXA型和其他不常見的基因型。表達(dá)ESBLs的細(xì)菌表現(xiàn)為全球廣泛性流行，不過各個國家、地區(qū)和各級醫(yī)院檢出的產(chǎn)ESBLs基因型和亞型構(gòu)成比不盡相同，其中以CTX-M、TEM、SHV型較為常見。加拿大學(xué)者研究結(jié)果表明，大腸桿菌中具有CTX-M 型占70.9%，SHV 型占3.6%，TEM型占2.2%[7]。國內(nèi)學(xué)者報道大腸桿菌中CTX-M型構(gòu)成比則高低不等，本研究數(shù)據(jù)顯示表達(dá)ESBLs大腸桿菌中CTX-M型為70.4%，高于貴州省的數(shù)據(jù)(35.5%)[8]，低于其他地區(qū)相關(guān)報道[9]。TEM型和SHV型比例較低(24.7%及0%)，和國內(nèi)文獻(xiàn)報道相比(TEM型為59.6%～86.3%，SHV型為3.5%～27.5%)而言，反映了本醫(yī)院ESBLs流行的基因型情況。本研究中基因型構(gòu)成比表明，兼具CTX-M與TEM 兩個基因型的菌株占4.9%，由分子機(jī)制揭示出了表達(dá)ESBLs致病菌所含耐藥基因的復(fù)雜多變性。

當(dāng)前，CTX-M 型按其同源性被劃分為5組(群)，每個組包含對應(yīng)的亞型。在各個時期和各個地區(qū)，CTX-M 各組和亞型分布情況不盡相同。本研究結(jié)果顯示出了類似的分布特征，CTX-M9組為44.4%(36/81)， CTX-M1組為18.5%(15/81) ，而CTX-M8組只有7.4%(6/81)，與國內(nèi)的相關(guān)報道基本一致[10-11]。本研究SHV和OXA型基因測定結(jié)果均為陰性，是否和引物序列設(shè)計、反應(yīng)體系環(huán)境、樣品大小或參數(shù)調(diào)整相關(guān)，還是由于當(dāng)前含有SHV和OXA的菌株并不常見，應(yīng)該做進(jìn)一步的研究與探索。一般而言，多數(shù) CTX-M 型ESBLs降解CTX與CRO能力強(qiáng)于降解CAZ，本研究的藥敏試驗結(jié)果也說明產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對CAZ的耐藥率比前兩者稍低。因為不同組別各亞型降解特性有所不同，CTX-M1組和CTX-M9組菌株對FEP、CAZ和AMT的耐藥率表現(xiàn)出一定的差別[12]?？紤]到產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的耐藥基因型流行情況過于復(fù)雜與多變性，并且表現(xiàn)出了地區(qū)性流行的特點，所以各個地方必須對本區(qū)域菌株實施監(jiān)控，從而為該菌感染性疾病的防控、診斷與治療提出充實的理由。

由于產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的耐藥基因由質(zhì)粒介導(dǎo)，質(zhì)粒也可攜帶針對喹諾酮類藥物耐受的基因qnr。相關(guān)整合子或者轉(zhuǎn)座子上的基因可以通過接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式在細(xì)菌之間相互傳遞、共享，從而導(dǎo)致大腸埃希菌對CIP和LVX等氟喹諾酮類抗菌藥物耐藥率較高，且出現(xiàn)一定的上升趨勢；但是碳青霉烯類抗菌素對ESBLs高度穩(wěn)定，故產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對該類抗菌素極為敏感；又因為ESBLs能被ESBLs抑制劑(例如棒酸、SCF和TZP等)抑制活性，故產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對該類復(fù)合抗菌素較為敏感；至于對AMK、NIT/FT也敏感，可能與該類藥物的腎毒性等副作用限制了它們在臨床上的廣泛使用，導(dǎo)致細(xì)菌的抗菌素選擇性壓力較低有關(guān)。本研究中，藥敏試驗的相關(guān)結(jié)果也證實了以上幾點。

總之，對大腸埃希菌耐藥性進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測，深入探討細(xì)菌耐藥性的分子機(jī)制，這對于阻斷該菌突變途徑，減少耐藥菌株的傳播，研發(fā)新的抗菌藥物，都具有堅實的理論和實踐意義。