陳 千，熊富良*，張雪瓊，周煉煉，李心愿，孫雅妮，劉 芮，唐 寒

(1.武漢理工大學(xué)化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430070； 2.武漢健民中維醫(yī)藥有限公司，武漢 430056；3.中南民族大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430074)

沙參麥冬湯為治療肺陰虛類咳嗽的經(jīng)典名方藥，出自清醫(yī)吳鞠通的《溫病條辨》，該復(fù)方由北沙參、麥冬、玉竹、天花粉、白扁豆、甘草、桑葉七味中藥材組成；沙參麥冬顆粒是在經(jīng)典名方沙參湯的基礎(chǔ)上，按照創(chuàng)新藥的要求，應(yīng)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)研制而成的中藥新品種；具有清肺養(yǎng)陰，潤(rùn)燥生津的功能，臨床用于肺陰虧耗類亞急性與慢性咳嗽的治療.方中北沙參、麥冬為君藥，甘寒生津、清養(yǎng)肺胃；玉竹、天花粉共為臣藥，清肺養(yǎng)陰、潤(rùn)燥養(yǎng)胃；白扁豆、甘草、桑葉三藥調(diào)和合為佐使，培土生津、瀉火和中、散熱散燥；諸藥配伍共奏清養(yǎng)肺胃，生津潤(rùn)燥之功效，乃甘寒之法[1].現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：沙參麥冬湯具有治療干眼癥、咳嗽變異性哮喘、肺陰虛咳嗽、抗腫瘤等功效，尤其是在抗肺癌方面具有很好的開發(fā)應(yīng)用前景[2-6].感染后咳嗽(post infectious cough，PIC)又稱感冒后咳嗽，指各種病原體所致的急性呼吸道感染癥狀消失后，但咳嗽仍遷延不愈的癥狀，通常持續(xù)3～8周，常伴有氣道高反應(yīng)，屬于亞急性咳嗽的一種，為呼吸科門診常見疾病[7-8].但目前無(wú)沙參麥冬顆粒治療感染后咳嗽(肺陰虛證)小鼠的相關(guān)研究，因此本文首次構(gòu)建感染后咳嗽(肺陰虛證)小鼠模型來(lái)深入探討研究沙參麥冬顆粒中甘草苷的止咳療效及抗氧化的作用機(jī)制.

本課題在前期實(shí)驗(yàn)研究中，通過(guò)構(gòu)建感染后咳嗽(肺陰虛證)小鼠模型來(lái)篩選沙參麥冬顆粒的止咳活性部位，研究結(jié)果表明該復(fù)方的乙酸乙酯部位浸膏具有較好的止咳作用，進(jìn)而深入研究其止咳活性物質(zhì)基礎(chǔ)，采用反復(fù)硅膠柱色譜法、半制備高效液相色譜法等多種色譜分離技術(shù)對(duì)乙酸乙酯部位浸膏進(jìn)行分離純化，并結(jié)合理化性質(zhì)、核磁、質(zhì)譜等鑒定手段對(duì)分離所得的12個(gè)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，其中包括甘草苷.甘草具有補(bǔ)脾益氣、清熱止咳、抗炎、抗氧化等功效，是我國(guó)重要的傳統(tǒng)中藥，在中醫(yī)上被尊稱為“國(guó)老”，甘草苷為甘草的黃酮類成分，亦具有抗炎、止咳等生物活性[9-10].因此，提示甘草苷可能為沙參麥冬顆粒治療感染后咳嗽(肺陰虛證)的重要止咳活性物質(zhì)，然而甘草苷的止咳及抗氧化作用的具體機(jī)制尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步探討甘草苷是否通過(guò)減少炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)、炎性細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)的釋放及表達(dá)，進(jìn)而減少氣道炎性反應(yīng)環(huán)境，降低咳嗽高敏感性來(lái)達(dá)到止咳的效果；是否通過(guò)提高肺組織的抗氧化酶(SOD、CAT)的活性來(lái)清除過(guò)量的活性氧自由基，減少過(guò)量的自由基在體內(nèi)堆積以達(dá)到抗氧化的作用；為沙參麥冬顆粒臨床上治療肺陰虛類亞急性咳嗽提供客觀科學(xué)依據(jù).

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Balb/c小鼠(SPF級(jí))，體質(zhì)量16～24 g，雌鼠(60只)，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(鄂)2015-0019.

1.2藥品與試劑

北沙參、麥冬、玉竹、天花粉、白扁豆、甘草、桑葉均購(gòu)于安徽敬道藥業(yè)有限公司，并嚴(yán)格按照中國(guó)藥典的要求鑒定藥材，均為合格藥材.紅金龍香煙(湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，焦油量、煙氣煙堿量、煙氣一氧化碳量分別為10、1、12 mg)；煙熏箱(捷貝有限公司，透明型，長(zhǎng)、寬、高分別為72、53、44 cm)；甲狀腺片(山東省惠諾藥業(yè)有限公司)；內(nèi)毒素(上海源葉生物科技有限公司)；辣椒素(成都瑞芬思生物科技有限公司)；孟魯司特鈉片(杭州默沙東制藥有限公司)；甘草苷(成都瑞芬思生物科技有限公司)；4%多聚甲醛(武漢賽維爾生物科技有限公司)；HE染色液(武漢賽維爾生物科技有限公司)；生理鹽水(武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司)；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；中性樹膠(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；小鼠TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE、SOD、CAT、MDA等進(jìn)口ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司).

1.3實(shí)驗(yàn)儀器

多功能誘咳引喘儀(上海欣軟信息科技有限公司)；微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；JJ-12J型脫水機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)；JB-P5型包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)；RM2016型病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)；Nikon Eclipse E100型正置光學(xué)顯微鏡(日本尼康)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(武漢一恒蘇凈科學(xué)儀器有限公司)；HT-111B型恒溫?fù)u床(上海赫田科學(xué)儀器有限公司)；XB220A型電子分析天平(瑞士普瑞賽斯)；JY98-IIIN型細(xì)胞破碎儀(寧波新芝生物科技有限公司)；低溫高速冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；RT-6100全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)雷杜).

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1小鼠造模與給藥 適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，開始造模.其中空白組(10只)不作任何處理，自由飲水進(jìn)食；余下50只小鼠，每次煙熏時(shí)，將其先放入自制的兩個(gè)煙熏箱中(25只小鼠·箱-1)，箱子右上角放置一艾灸盒，第1～10 d上下午分別點(diǎn)燃4支香煙放入艾灸盒中的衛(wèi)生紙上，蓋上蓋子，其上再以毛巾覆蓋，防止煙霧溢出，30 min后取出小鼠，2次·d-1，持續(xù)10 d；第11、14、17 d上午以濃度為0.4 mg·mL-1的LPS滴鼻，按10 μL·10g-1體重計(jì)算滴鼻量；第11～19 d下午以濃度為30 mg·mL-1的甲狀腺素混懸液灌胃，每只小鼠的灌胃劑量為0.3 mL；并分別于第12、13、15、16、18、19 d晚上以濃度為1×10-4mol·L-1的辣椒素霧化誘咳，每次霧化時(shí)間為3 min，1次·d-1.于造模第20 d，使用多功能誘咳引喘儀對(duì)造模小鼠進(jìn)行辣椒素誘咳激發(fā)實(shí)驗(yàn)，若小鼠頻繁噴嚏、頸部伸向前、腹肌抽搐、張口等特征性體位出現(xiàn)，且3 min內(nèi)咳嗽次數(shù)約10次左右，即提示造模成功[7].

造模成功后，隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性組、甘低組、甘中組、甘高組；空白組和模型組均給予等量的生理鹽水灌胃，陽(yáng)性組給予1.2 mg·kg-1的孟魯司特鈉混懸液(混懸在0.5%CMC-Na中)灌胃，甘草苷低、中、高組分別給予25、50、100 mg·kg-1的甘草苷混懸液(同上)灌胃，每組10只；各組灌胃劑量均為0.1 ml·10 g-1體質(zhì)量，1次·d-1，連續(xù)給藥7 d.

1.4.2小鼠行為學(xué)觀察與體質(zhì)量監(jiān)測(cè) 仔細(xì)觀察每組小鼠在造模前后的皮毛光澤、有無(wú)脫毛、大便干濕狀態(tài)、自由活動(dòng)狀態(tài)、精神狀況以及有無(wú)哮鳴音等.

適應(yīng)性飼養(yǎng)完畢后，在造模期間第1 d測(cè)一次體質(zhì)量作為基礎(chǔ)值，煙熏期間每10 d測(cè)一次體質(zhì)量，煙熏后每5 d測(cè)一次體質(zhì)量，造模完畢后，給藥第7 d再測(cè)一次體質(zhì)量，記錄好實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，觀察各組小鼠的體質(zhì)量變化.

1.4.3小鼠咳嗽敏感性測(cè)定 末次給藥24 h后，取1×10-4mol·L-1的辣椒素溶液作為誘咳液，加入多功能誘咳引喘儀的霧化器中，霧化3 min，霧化停止后再觀察2 min，記錄各組小鼠在5 min內(nèi)的首咳時(shí)間及咳嗽次數(shù).

1.4.4小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE的水平含量測(cè)定 咳嗽敏感性測(cè)定完畢后，采用眼球取血法收集各組小鼠的外周全血，將收集好的全血標(biāo)本放入低溫高速冷凍離心機(jī)中，設(shè)置離心條件為低溫4 ℃、4 500 r·min-1、離心25 min，離心完畢后取其上清液即為小鼠血清，將小鼠血清置于-20 ℃下凍存.采用ELISA法測(cè)定各組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE的水平含量，操作過(guò)程及方法均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行.

1.4.5小鼠肺組織病理學(xué)觀察 各組小鼠眼球取血完畢后，立即解剖取出部分肺組織放入4%多聚甲醛中固定，常規(guī)取材脫水后，石蠟包埋切片，并用HE染色液染色.脫水封片后用光學(xué)顯微鏡觀察支氣管及肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況，支氣管黏膜上皮細(xì)胞和肺泡壁損害情況等病理變化.

1.4.6小鼠肺組織中SOD、CAT、MDA的水平含量測(cè)定 各組小鼠眼球取血完畢后，立即取出部分肺組織放入凍存管中于-20 ℃下凍存.用預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS緩沖液)沖洗肺組織，除去其殘留血液，稱重后將肺組織剪碎.將剪碎的肺組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS緩沖液加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨，以制備10%的肺組織勻漿，最后將勻漿液于5000×g條件下離心10 min，取其上清液檢測(cè).采用ELISA法檢測(cè)各組小鼠肺組織中SOD、CAT、MDA的水平含量，操作過(guò)程及方法均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行.

2結(jié)果與分析

2.1甘草苷對(duì)小鼠行為學(xué)及體質(zhì)量的影響

在造模期間，空白組小鼠不受影響，小鼠性格溫順，毛發(fā)光澤，反應(yīng)靈敏，進(jìn)食主動(dòng)，無(wú)哮鳴音；與空白組比較，模型組小鼠膽小易驚，毛發(fā)枯黃無(wú)光澤、易脫毛，肌肉松弛，大便稀溏，不喜進(jìn)食，倦怠蜷臥，有哮鳴音；其他各組小鼠狀態(tài)與模型組小鼠無(wú)明顯差異.在給藥期間，空白組小鼠的精神活動(dòng)狀態(tài)較造模期無(wú)明顯變化；模型組小鼠的精神活動(dòng)狀態(tài)較造模期亦無(wú)明顯變化；與模型組比較，陽(yáng)性組及甘草苷低、中、高組小鼠的精神活動(dòng)狀態(tài)均有所好轉(zhuǎn)，小鼠反應(yīng)能力均逐漸靈敏輕快，肌肉逐漸緊實(shí)，毛發(fā)逐漸有光澤，亦逐漸喜主動(dòng)進(jìn)食.

由表1可知，在造模期間，空白組小鼠不受影響，其體質(zhì)量穩(wěn)健增長(zhǎng)；與空白組比較，其他各組小鼠體質(zhì)量均逐漸明顯下降，差異均具有極其顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001).在給藥期間，空白組小鼠體質(zhì)量依舊穩(wěn)健增長(zhǎng)；與空白組比較，模型組小鼠體質(zhì)量回升緩慢，差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；其他給藥組小鼠的體質(zhì)量均逐漸回歸正常水平，且差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.與模型組比較，其他給藥組小鼠的體質(zhì)量均逐漸回歸正常水平，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01).結(jié)果表明：采用煙熏+LPS滴鼻+甲狀腺素灌胃+辣椒素誘咳能引起小鼠體質(zhì)量的明顯減輕，成功模擬了肺陰虛證形體消瘦的病理生理特征；甘草苷低、中、高劑量組均可改善小鼠的精神活動(dòng)狀態(tài)并有效治療小鼠的肺陰虛病征.

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化(n=10)Tab.1 Changes of body mass in each group (n=10)

2.2甘草苷對(duì)小鼠咳嗽敏感性的影響

由表2可知，各組小鼠經(jīng)辣椒素霧化誘咳后，均有不同程度的咳嗽.空白組小鼠的咳嗽潛伏期較長(zhǎng)，并出現(xiàn)少量咳嗽；模型組、其他給藥組小鼠的咳嗽潛伏期及咳嗽次數(shù)呈不同程度的縮短和增多.與空白組比較，模型組、陽(yáng)性組、甘低組、甘中組小鼠的咳嗽潛伏期均不同程度的明顯縮短，差異均具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.001)；甘高組小鼠的咳嗽潛伏期稍有縮短，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；模型組、陽(yáng)性組、甘低組、甘中組、甘高組小鼠的咳嗽次數(shù)均不同程度的明顯增多，差異均具有極其顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001).與模型組比較，陽(yáng)性組、甘中組、甘高組小鼠的咳嗽潛伏期均不同程度的明顯延長(zhǎng)，差異均具有極其顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；甘低組小鼠的咳嗽潛伏期稍有延長(zhǎng)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；陽(yáng)性組、甘低組、甘中組、甘高組小鼠的咳嗽次數(shù)均不同程度的明顯減少，差異均具有極其顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001).結(jié)果表明：甘草苷中、高劑量組可明顯延長(zhǎng)感染后咳嗽(肺陰虛證)小鼠的咳嗽潛伏期；甘草苷低、中、高劑量組可明顯減少感染后咳嗽(肺陰虛證)小鼠的咳嗽次數(shù)；甘草苷可呈劑量依賴性降低感染后咳嗽(肺陰虛證)小鼠的咳嗽高敏感性，以達(dá)到養(yǎng)陰止咳的目的.

表2 各組小鼠咳嗽敏感性測(cè)定Tab.2 Determination of cough sensitivity in each group

2.3甘草苷對(duì)小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE水平含量的影響

由表3、表4可知，與空白組比較，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE

水平含量均顯著增高，差異均具有極其顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；陽(yáng)性組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、IgE水平含量稍有增高，TGF-β1水平含量稍有降低，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；甘低組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE水平含量均增高較多，差異均具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.001)；甘中組小鼠血清中TNF-α水平含量增高較多，差異具有極其顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE水平含量有所增高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；甘高組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2水平含量有所增高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，TGF-β1、IgE水平含量稍有增高，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.與模型組比較，陽(yáng)性組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE水平含量均顯著降低，差異均具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.001)；甘低組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、IgE水平含量有所降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TLR2、TGF-β1水平含量稍有降低，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；甘中組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE水平含量均降低較多，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；甘高組小鼠血清中TNF-α、IL-13、IgE水平含量均顯著降低，差異均具有極其顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，IL-6、TLR2、TGF-β1水平含量均降低較多，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01).結(jié)果表明：甘草苷可呈劑量依賴性減少小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE的水平含量.

2.4甘草苷對(duì)肺組織病理變化的影響

由圖1可知，空白組小鼠肺組織基本正常；模型組小鼠肺組織的肺泡壁薄，可見輕微增厚，黑色箭頭周圍可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；陽(yáng)性組、甘低組、甘中組、甘高組小鼠肺組織的肺泡壁、支氣管等結(jié)構(gòu)較清晰完整，上皮細(xì)胞形態(tài)較正常，肺泡壁較薄，未見明顯增厚，未見明顯炎癥反應(yīng)，與空白組小鼠肺組織無(wú)明顯差異.結(jié)果表明：甘草苷可有效減輕感染后咳嗽(肺陰虛證)小鼠肺組織中的炎癥反應(yīng).

表3 小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-13水平含量的測(cè)定(n=5)Tab.3 Determination of TNF-α，IL-6 and IL-13 levels in serum of mice (n=5)

續(xù)表3

表4 小鼠血清中TLR2、TGF-β1、IgE水平含量的測(cè)定(n=5)Tab.4 Determination of TLR2，TGF-β1 and IgE levels in serum of mice (n=5)

A) 空白組；B) 模型組；C) 陽(yáng)性組；D) 甘低組；E) 甘中組；F) 甘高組；A)～F) HE×200，標(biāo)尺線長(zhǎng)度為100 μmA) Control group; B) Model group; C) Positive group; D) Glycyrrhizin low-dose group; E) Glycyrrhizin median-dose group; F) Glycyrrhizin high-dose group; A)-F) HE×200;scale bar：100 μm圖1 各組小鼠肺組織病理變化Fig.1 Pathological changes of lung tissue in mice

2.5甘草苷對(duì)小鼠肺組織中SOD、CAT、MDA水平含量的影響

由表5可知，與空白組比較，模型組小鼠肺組織中SOD、CAT水平含量均顯著下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，MDA水平含量顯著升高，差異具有極其顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；陽(yáng)性組小鼠肺組織中SOD水平含量稍有下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CAT、MDA水平含量稍有下降，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；甘低組、甘中組小鼠肺組織中SOD、CAT水平含量均有所下降，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，MDA水平含量均有所升高，但差異均具有極其顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；甘高組小鼠肺組織中SOD、CAT水平含量均稍有下降，MDA水平含量稍有升高，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.與模型組比較，陽(yáng)性組小鼠肺組織中SOD、CAT水平含量均明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，MDA水平含量顯著下降，差異具有極其顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；甘低組、甘中組小鼠肺組織中SOD水平含量均有所上升，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，CAT水平含量均稍有上升，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，MDA水平含量均有所下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；甘高組小鼠肺組織中SOD水平含量有所上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CAT水平含量有所上升，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，MDA水平含量顯著下降，差異具有極其顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001).結(jié)果表明：甘草苷可有效增高小鼠肺組織中SOD的水平含量，并呈一定劑量依賴性降低小鼠肺組織中MDA的水平含量.

表5 小鼠肺組織中SOD、CAT、MDA水平含量的測(cè)定(n=5)Tab.5 Determination of SOD，CAT and MDA levels in lung tissues of mice(n=5)

3討論

目前關(guān)于肺陰虛慢性咳嗽動(dòng)物模型的建立方法，主要以煙熏(SO2熏)+甲狀腺素灌胃+利血平灌胃為主[11-12]；感染后咳嗽動(dòng)物模型的建立方法，主要以煙熏+LPS滴鼻+辣椒素霧化為主[13]；病征結(jié)合模型即感染后咳嗽(肺陰虛證)大鼠模型的建立方法為煙熏+LPS滴鼻+甲狀腺素灌胃+辣椒素霧化[7]，但無(wú)感染后咳嗽(肺陰虛證)小鼠模型的建立方法，參考感染后咳嗽(肺陰虛證)大鼠模型的建立方法，該模型小鼠的建立方法依舊為煙熏+LPS滴鼻+甲狀腺素灌胃+辣椒素霧化，但通過(guò)調(diào)整煙熏香煙的支數(shù)、LPS滴鼻的劑量以及甲狀腺素灌胃的劑量來(lái)構(gòu)建.故本研究先采用紙煙煙熏法誘導(dǎo)小鼠形成氣道高反應(yīng)，然后用LPS滴鼻誘導(dǎo)小鼠氣道產(chǎn)生炎性反應(yīng)、釋放炎性介質(zhì)，再灌服甲狀腺素使之陰虛燥熱、形體消瘦、灼傷陰津，最后定期用辣椒素霧化誘導(dǎo)小鼠咳嗽，復(fù)制出感染后咳嗽(肺陰虛證)小鼠的病征結(jié)合動(dòng)物模型.

研究表明，有多種炎性細(xì)胞、炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子參與形成氣道炎性反應(yīng)，如TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE等表達(dá)增加.TNF-α是細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的啟動(dòng)因子，為主要由巨噬細(xì)胞分泌的一類肽類炎性介質(zhì)，可有效激活中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、白介素等一系列細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，使氣道產(chǎn)生炎性環(huán)境，啟動(dòng)肺組織炎性反應(yīng)，產(chǎn)生細(xì)胞因子的瀑布效應(yīng)[14]；IL-6為主要由活化的T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的一種多效細(xì)胞炎癥因子，可介導(dǎo)炎性反應(yīng)效應(yīng)而加劇炎癥瀑布反應(yīng)[15]；IL-13為由2型輔助型淋巴細(xì)胞(Th2細(xì)胞)產(chǎn)生的一種多效細(xì)胞炎癥因子，可誘導(dǎo)B細(xì)胞的增殖及合成IgE類受體，具有促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生表達(dá)嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子作用，進(jìn)而加劇氣道炎性環(huán)境[16]；Toll樣受體(toll-like receptor，TLR)最早發(fā)現(xiàn)于果蠅體內(nèi)，TLRs家族是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵受體蛋白，TLR2是TRLs家族中研究最早分布最廣泛的成員，受到內(nèi)外源性配體刺激后，可通過(guò)刺激觸發(fā)骨髓分化因子88依賴性信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)，NF-κB活化后可進(jìn)一步啟動(dòng)TNF-α、IL-1、IL-8等一系列炎性細(xì)胞因子的釋放表達(dá)，來(lái)參與各種炎癥疾病過(guò)程[17].TGF-β1為一種多功能的細(xì)胞因子，是一種強(qiáng)有力的促成纖維細(xì)胞分裂因子，可使肺成纖維細(xì)胞發(fā)生過(guò)度增殖和分化，進(jìn)而趨化炎性細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞，并促進(jìn)其合成釋放TNF-α、IL-1、IL-6等炎性細(xì)胞因子，來(lái)參與炎癥反應(yīng)[14，18].IgE主要通過(guò)激活肥大細(xì)胞來(lái)改變氣道反應(yīng)性，并參與介導(dǎo)變應(yīng)性炎性反應(yīng)，使氣道平滑肌呈易激性、易痙攣狀態(tài)，進(jìn)而誘發(fā)氣道高反應(yīng)性的形成，同時(shí)可引起氣道滲出增加、上皮損傷等其它氣道炎性反應(yīng)的發(fā)生，進(jìn)一步加劇氣道高反應(yīng)性及咳嗽高敏感性[7].健康人體內(nèi)不會(huì)過(guò)多積累自由基，如果體內(nèi)抗氧化平衡系統(tǒng)遭到破壞，則體內(nèi)會(huì)堆積過(guò)量自由基，進(jìn)而引發(fā)一系列過(guò)氧化反應(yīng)，加速衰老；抗氧化酶是抗氧化系統(tǒng)中不可或缺的重要組成部分，可有效清除機(jī)體內(nèi)過(guò)量的活性氧自由基、活性氧類、過(guò)氧化物的生成，保護(hù)機(jī)體免受自由基損傷從而延緩衰老；SOD、CAT均是體內(nèi)至關(guān)重要的抗氧化劑，SOD是機(jī)體抵抗氧化損傷的重要保護(hù)屏障之一，可有效促進(jìn)自由基的清除，CAT可有效分解機(jī)體內(nèi)的過(guò)氧化氫(H2O2)，釋放新生態(tài)氧氣，進(jìn)而在體內(nèi)起到解毒及保護(hù)巰基的作用；MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的代謝產(chǎn)物，其含量高低與脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)呈正向，可直接反映機(jī)體的脂質(zhì)過(guò)氧化水平，代表著組織氧化損傷程度[19-20].

綜上所述，3種不同濃度的甘草苷均可有效減少感染后咳嗽(肺陰虛證)小鼠的咳嗽次數(shù)，其中甘草苷中、高劑量組可有效延長(zhǎng)小鼠的咳嗽潛伏期，降低其氣道高敏感性；其作用機(jī)制可能為減少小鼠氣道中TNF-α、IL-6、IL-13、TLR2、TGF-β1、IgE等細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)的釋放，進(jìn)而減輕氣道感染性及變態(tài)性炎性反應(yīng)環(huán)境來(lái)降低咳嗽高敏感性，減少對(duì)咳嗽中樞的刺激來(lái)達(dá)到止咳的目的.3種不同濃度的甘草苷均可有效提高小鼠肺組織中SOD的含量，減少小鼠肺組織中MDA的含量，來(lái)改善體內(nèi)抗氧化平衡系統(tǒng)的紊亂，有效清除機(jī)體中的過(guò)量自由基，提高機(jī)體內(nèi)抗氧化酶的含量，以減輕氧化損傷來(lái)達(dá)到抗氧化的目的.