邸 松，戴麗瑩，鐘方麗，張曉麗，2，王曉林*

(1.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022； 2.吉林大學(xué)，長春 130012)

伴隨醫(yī)學(xué)模式從傳統(tǒng)的生物醫(yī)學(xué)過度到全新的生物-心理-社會醫(yī)學(xué)的模式[1]，亞健康這種處于健康與疾病之間的第三狀態(tài)[2]，受到人群的廣泛關(guān)注.疲勞性亞健康是亞健康中一種常見類型[3]，在人群中的發(fā)生率約為7%～45%[4]，長期處于該狀態(tài)下的人群可能導(dǎo)致癌癥、人體免疫性缺陷、病毒感染等疾病[5-6].隨國民健康意識的不斷提高，保健食品這種不以治療疾病為目的，具有特定保健功能的食品需求量持續(xù)提升[7].在保健食品的27種保健功能中[8]，具有抗疲勞功效的保健食品可以有效的改善疲勞狀態(tài).課題組選用三種藥食同源[9]、具有抗疲勞作用的刺玫果[10]、人參[11]及刺五加[12]進行處方設(shè)計，采用提取、制劑技術(shù)制備成具有抗疲勞功效的中藥類保健食品[13]雙刺參膠囊.

經(jīng)文獻查閱，中藥材中皂苷類成分的提取，通常采用乙醇熱回流[14]、超高壓提取[15]、超聲提取[16]和酶輔助超聲提取[17]等方法.這些方法的乙醇投入量大、能源消耗高，且只能有效的提取一種有效成分.本試驗參考韓寒冰[18]的方法，采用柱層析循環(huán)聯(lián)合法，探索同時提取雙刺參膠囊中的總皂苷及多糖的最佳工藝，為雙刺參膠囊的工業(yè)生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1試驗材料

刺五加、刺玫果、人參：購買于吉林國安藥業(yè)有限公司，于60 ℃下干燥至恒重后粉碎，取過80目篩粉末，按處方量進行混合得到雙刺參混合粉；香草醛：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；苯酚、無水乙醇及其他分析純試劑：天津大茂化學(xué)試劑廠.

1.2試驗儀器

TU-1950型紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；H1850型臺式高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司.

1.3試驗方法

1.3.1總皂苷及總多糖含量測定方法

1) 總皂苷含量測定采用香草醛-乙醇-硫酸顯色法[19]，吸取提取液適量，80 ℃水浴蒸干溶劑，加入0.5 mL 8%香草醛-乙醇溶液溶解殘渣后，加入5 mL 72%硫酸溶液混合均勻，置于60 ℃水浴震蕩(150 r·min-1)15 min，冷水浴迅速冷卻10 min，室溫靜置15 min后，在540 nm下測定吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(y=23.01x+0.0577，R2=0.9994)，將測定值帶入公式(1)計算總皂苷提取率.

(1)

式中,ρZ為提取液中皂苷濃度(mg·mL-1)；VZ為總皂苷提取液體積(mL)；mZ為雙刺參粉中總皂苷的總量(mg).

2) 總多糖含量測定吸取提取液適量，按照苯酚-硫酸顯色法進行測定[20]，將測定的吸光度數(shù)值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(y=38.698x+0.0597，R2=0.9997)，將測定值帶入公式(2)計算計算總多糖提取率.

(2)

式中,ρT為提取液中多糖濃度(mg·mL-1)；VT為多糖提取液體積(mL)；mT為雙刺參粉中多糖的總量(mg).

1.3.2提取工藝條件的選擇

1) 提取溶劑的選擇稱定雙刺參粉末6份，每份1.0 g，分別按照料液比1∶10(g∶mL)加入體積比(乙醇∶水)為10∶0、8∶2、6∶4、4∶6、2∶8、0∶10的提取溶劑，室溫下?lián)u床震蕩1 h(200 r·min-1)，低溫離心(6000 r·min-1)10 min，取上清液適量，分別按照總皂苷及多糖的含量測定方法測定，計算總皂苷及多糖的提取率，分別確定雙刺參總皂苷及多糖的提取溶劑.

2) 吸漲率的測定取1.0 g雙刺參粉末16份，分別按照料液比1∶10(g∶mL)加入總皂苷提取溶劑及多糖提取溶劑，室溫下分別搖床震蕩10 min(200 r·min-1)、20 min、0.5、1、2、3、4、5 h后，離心，測定上清液體積，其與總體積的差值即為吸漲率(吸漲體積).

3) 浸泡平衡時間的測定在測定吸漲率時，分別測定不同震蕩時間上清液中總皂苷及多糖的含量，當(dāng)上清液中對應(yīng)的總皂苷及多糖含量基本不變時所對應(yīng)的時間，即為浸泡平衡時間.

1.3.3柱層析法分別提取雙刺參總皂苷及總多糖

1) 提取次數(shù)的確定取直徑為1.5 cm的玻璃層析柱，稱取雙刺參粉末5.0 g，按料液比(m∶V)1∶1加入提取總皂苷對應(yīng)的提取溶劑，混合均勻后濕法上柱，保持溶劑沒過樣品，浸泡至平衡時間，以0.4 mL·min-1收集流出液，對應(yīng)吸漲體積為1份，收集3份后，殘渣加入吸漲體積的提取溶劑，經(jīng)超聲提取1 h后抽濾，得到第4份提取液，分別測定各份提取液中總皂苷含量，4份提取液中總皂苷的含量之和視為雙刺參粉中總皂苷的總量，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)確定提取次數(shù).以純水為提取溶劑，采用同樣的方法，確定雙刺參粉中多糖的總量及其提取次數(shù).

2) 提取流速的確定選取直徑為1.5 cm的玻璃層析柱，按1.3.3方法進行上柱，以吸漲體積為一個收集單位，分別以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL·min-1的流速收集提取液，測定洗脫液中總皂苷的含量，從而確定總皂苷的提取流速.以純水為提取溶劑，采用同樣的方法確定多糖的提取流速.

1.3.4柱層析循環(huán)聯(lián)合法提取雙刺參總皂苷及總多糖

1) 直接連續(xù)提取法總皂苷及總多糖提取連續(xù)進行，優(yōu)先提取總皂苷.選用4根1.5 cm的玻璃層析柱，稱取4份雙刺參粉末各5.0 g，濕法上第1根柱，其余操作同分別提取總皂苷的方法，只是根據(jù)總皂苷的提取次數(shù)，在收集最后一次提取液時，更換為總多糖的提取溶劑純水，將總皂苷提取溶劑收集完畢，繼續(xù)添加多糖提取溶劑，按提取次數(shù)提取多糖.各洗脫液的最后一份，作為下一根層析柱的第一份洗脫液，從第二根柱開始，不浸泡至平衡時間，如此循環(huán)，測定并計算總皂苷及多糖提取率.

2) 浸泡至平衡時間連續(xù)提取法提取方法同上，不同的是，在更換提取溶劑及提取下一根層析柱時，須在層析柱內(nèi)靜置浸泡至平衡時間后再進行接樣，并測定含量，計算提取率.

1.3.5總皂苷及多糖的分離 將雙刺參總皂苷及總多糖的提取液合并，減壓濃縮至20 mL，加入無水乙醇80 mL，充分混合均勻，置于4 ℃冰箱靜置12 h，低溫離心10 min(6 000 r·min-1).上清液為總皂苷液，沉淀為粗多糖.將上清液減壓濃縮，分別將濃縮液與粗多糖置于60 ℃烘箱中進行干燥，得到干浸膏，分別測定干浸膏中總皂苷及多糖含量.

1.3.6多糖的純化 取粗多糖重新溶于蒸餾水中，80%乙醇進行沉淀，放置在冰箱(4 ℃)中12 h后進行離心10 min(6 000 r·min-1)，將所得沉淀重復(fù)上述實驗1次，經(jīng)干燥后得到多糖粉末，測定多糖含量.

1.4雙刺參總皂苷體外抗氧化試驗

1.4.1清除DPPH自由基試驗 吸取0.1 mg·mL-1DPPH自由基溶液17 mL于25 mL容量瓶中，加入無水乙醇定容，制備DPPH自由基溶液.吸取2 mL不同質(zhì)量濃度的供試品溶液(總皂苷提取物溶液和Vc溶液)與2 mLDPPH自由基溶液，混合，混合液在室溫下避光反應(yīng)30 min，在517 nm下測定吸光度Ay，同法操作，用2 mL無水乙醇代替供試品溶液測定Ak，2 mL無水乙醇代替DPPH自由基溶液測定Ad[21]，按式(3)計算自由基清除率，并其計算IC50值.

DPPH自由基清除率(%)=

[(Ak-Ay+Ad)/Ad]×100%.

(3)

1.4.2清除羥基自由基試驗 參考文獻[22]的方法，在10 mL比色管中加入1 mL鄰二氮菲，2 mLPBS緩沖液(pH=7.4)，1 mL FeSO4及1 mL 0.1%的H2O2溶液，37 ℃恒溫條件下反應(yīng)60 min，于536 nm處測得Ap，將1 mL 0.1%的H2O2溶液替換為1 mL蒸餾水，同法操作測得Ab，用1 mL不同質(zhì)量濃度的雙刺參提取物溶液替換1 mL蒸餾水測得As，將測得數(shù)據(jù)代入式(4)計算清除率及IC50.

羥基自由基清除率(%)=

[(As-AP)/(Ab-Ap)]×100%.

(4)

2結(jié)果與分析

2.1提取工藝條件的確定

2.1.1提取溶劑的確定 皂苷類成分易溶于乙醇溶液，多糖類成分易溶于水，根據(jù)測定的各溶液中總皂苷及多糖含量繪制圖1，從圖1可以看出，當(dāng)提取溶劑體積比(乙醇:水)為4∶6時，提取液中總皂苷的濃度達到最大值5.59 mg·mL-1，當(dāng)提取溶劑體積比(乙醇:水)為0∶10(純水)時，提取液中多糖的濃度達到最大值35.56 mg·mL-1，故在柱層析循環(huán)提取時，總皂苷提取溶劑選用40%乙醇溶液，多糖提取溶劑選擇純水.

圖1 提取溶劑的選擇Fig.1 Selection of extraction solvent

2.1.2吸漲率及浸泡平衡時間的確定 通過測定，雙刺參粉末對40%乙醇溶液及純水的吸收量不相同，從圖2可以看出，兩者分別為3.8 mL·g-1和3.6 mL·g-1，故提取總皂苷時按照雙刺參粉末質(zhì)量的3.8倍(g∶mL)收集提取液，提取總多糖時按照雙刺參粉末質(zhì)量的3.6倍(m∶V)進行收集.通過對提取液中多糖及總皂苷的含量測定，隨著浸泡時間的延長，提取液中總皂苷及多糖的質(zhì)量濃度逐漸升高，在浸泡時間達到2 h后，提取液中總皂苷及多糖的質(zhì)量濃度變化不大，因此確定樣品在層析柱中的浸泡時間為2 h，試驗結(jié)果見圖3.

圖2 吸漲率的測定結(jié)果Fig.2 Measurement results of swelling rate

圖3 浸泡時間的確定Fig.3 Determination of Soaking Time

2.2柱層析法分別提取雙刺參總皂苷及總多糖工藝條件的確定

2.2.1提取次數(shù)的確定 通過測定雙刺參總皂苷及總多糖的3份提取液及1份殘渣超聲提取液中對應(yīng)總皂苷及多糖的含量，以4份提取液中的總含量作為總量，當(dāng)提取液中提取的對應(yīng)成分達到總量的95%以上時，視為完全提取，試驗結(jié)果見圖4.根據(jù)試驗結(jié)果，總皂苷需要收集2份提取液，第2份提取液因濃度較低，作為下一根層析柱總皂苷提取溶劑；多糖因前2份提取液提取率相差不大，故需要收集3份提取液，第3份提取液作為下一根層析柱多糖的提取溶劑.

圖4 提取次數(shù)的確定Fig.4 Determination of extraction times

2.2.2洗脫流速的確定 從圖5中可以看出，當(dāng)洗脫流速在0.2～0.4 mL·min-1時，洗脫液中總皂苷及多糖的質(zhì)量濃度相差不大，當(dāng)洗脫流速增加到0.6 mL·min-1及以上時，洗脫液中的總皂苷及總多糖的質(zhì)量濃度明顯下降，考慮實際生產(chǎn)需求，以0.2 mL·min-1的流速進行收集，總皂苷和多糖的提取效率略有提升，但生產(chǎn)效率較低，所以選擇0.4 mL·min-1的流速進行收集.

圖5 洗脫流速的確定Fig.5 Determination of elution flow rate

圖6 提取方式比較Fig.6 Comparison of extraction methods

2.3柱層析循環(huán)聯(lián)合法提取雙刺參總皂苷及總多糖

從圖6可以看出，采用直接連續(xù)提取法時，從第二根層析柱開始，總皂苷及多糖的提取率明顯下降，雖然提取率呈現(xiàn)遞增趨勢，但總皂苷及多糖的整體提取率低于65%.浸泡至平衡時間提取時，總皂苷及多糖的提取率逐漸提升，在第四根層析柱時總皂苷及多糖的提取率分別達到96.56%和99.37%.故選用浸泡至平衡時間提取總皂苷及多糖.

2.4總皂苷及總多糖分離試驗結(jié)果

將雙刺參總皂苷及總多糖的循環(huán)提取液合并后，經(jīng)濃縮、醇沉、干燥，分別得到總皂苷及粗多糖干浸膏，稱重，并測定干浸膏中多糖及皂苷的含量，計算干浸膏收率，試驗結(jié)果見表1.

表1 總皂苷及總多糖分離試驗結(jié)果Tab.1 Test results of total saponins and total polysaccharides

2.5多糖純化試驗結(jié)果

對得到的粗多糖進行2次水溶醇沉法純化后，干燥，經(jīng)過測定，純化后的多糖含量從粗多糖的48.37%提升到了69.91%.

2.6總皂苷抗氧化試驗結(jié)果

雙刺參總皂苷提取物清除DPPH自由基、羥基自由基能力與濃度呈正相關(guān)趨勢，即隨著總皂苷質(zhì)量濃度的增加，清除率隨之增大.通過計算，總皂苷對兩種自由基清除的半數(shù)抑制濃度分別為8.93、12.99 mg·mL-1，與Vc的半數(shù)抑制濃度3.88、1.43 mg·mL-1相比差距較大，說明雙刺參總皂苷具有一定的抗氧化能力，但是弱于Vc.

圖7 抗氧化試驗結(jié)果Fig.7 Antioxidant test results

3結(jié)論與討論

本試驗通過柱層析聯(lián)合循環(huán)提取，分別采用料液(m∶V)比為1∶3.8的40%乙醇、1∶3.6的純水，浸泡2 h后，以0.4 mL/min的流速提取雙刺參粉末中的總皂苷及多糖.在此條件下，總皂苷及多糖的提取率均超過95%，混合提取液經(jīng)醇沉法一步分離，得到皂苷溶液及多糖沉淀，經(jīng)干燥后測定總皂苷及多糖的干浸膏得率分別為16.08%和3.68%；干浸膏中總皂苷及多糖的含量分別為18.06%和48.37%.粗多糖經(jīng)2次水溶醇沉后，多糖含量從48.37%提升到了69.91%.

天然植物中活性成分如皂苷、多糖等的提取方法有多種，例如，傳統(tǒng)經(jīng)典的溶劑熱回流提取、或者采用超聲波、微波、酶輔助等來提高提取率，但是這些提取方法都存在著提取次數(shù)多、提取溫度高、熱敏性物質(zhì)易被破壞、溶劑用量大、每次只提取一種活性成分等缺點，而柱層析循環(huán)聯(lián)合法可以克服上述缺陷.

在前期的研究中，曾對乙醇熱回流法提取雙刺參膠囊中總皂苷進行工藝優(yōu)化，在最優(yōu)條件下，可使總皂苷的提取率達到28.17 mg·g-1，其干浸膏中總皂苷的含量為15.78%.在柱層析循環(huán)法聯(lián)合提取法中，按照同樣的方法計算總皂苷的提取率可以達到29.03 mg·g-1，含量為18.05%，與乙醇熱回流法相比，提取率及總皂苷含量略有提高.乙醇熱回流法的最佳工藝需要5倍量90%乙醇，80 ℃水浴提取2次，每次1 h，相比較于柱層析循環(huán)法聯(lián)合提取的3.8倍40%乙醇，常溫條件下提取，在乙醇用量和能源消耗上較大.故柱層析循環(huán)聯(lián)合法需要的溶劑少、提取溫度低、能夠避免熱敏性物質(zhì)被破壞、工藝簡單、在提取總皂苷的同時可以提取總多糖，更有利于工業(yè)生產(chǎn)，也為雙刺參膠囊的下一步研究提供了實用性數(shù)據(jù).