楊凱越，宋彩玲，李彤彤，王文靜，陳慧宇，趙爽爽，劉明

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所/獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069)

犬細(xì)小病毒(canine parvovirus，CPV)屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬成員，是引起幼犬嚴(yán)重腸胃炎的主要病原之一，特別是沒有免疫的幼犬或者沒有母源抗體的幼犬更易感染犬細(xì)小病毒病[1-2]。該病毒在1977年首次從患有出血性腸炎的病犬糞便中觀察到，1978年便從患有腸炎的病犬體內(nèi)分離得到，隨后在世界各地的犬科動(dòng)物中相繼被發(fā)現(xiàn)[3-4]。病犬以劇烈嘔吐、腹瀉、白細(xì)胞顯著減少為主要特征，且該病一年四季均可發(fā)生[5]。

犬細(xì)小病毒病自暴發(fā)以來，因其高致病率和高死亡率，給養(yǎng)犬業(yè)、經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的影響，也危害了野生動(dòng)物的生存，因此開展對(duì)CPV感染診斷防治方面的研究至關(guān)重要。單克隆抗體(monoclonal antibodies,MAb)因其高特異性和高均一性已經(jīng)在疾病的診斷和治療中被廣泛應(yīng)用[6-7]?？笴PV 的MAb已成為治療和診斷犬細(xì)小病毒病的主要工具之一。本試驗(yàn)制備了抗CPV MAb，并對(duì)獲得的MAb進(jìn)行了效價(jià)、中和活性和亞類方面的鑒定，篩選到了3株效價(jià)較高、特異性較好的雜交瘤細(xì)胞株，為犬細(xì)小病毒病的診斷、治療及后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

毒株CPV-YN由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，pCI-NS和pCI-VP1表達(dá)質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，SP2/0骨髓瘤細(xì)胞和F81細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM培養(yǎng)基、完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、HAT、HT、50% PEG、山羊抗小鼠IgG-FITC和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(IgG-HRP)均購(gòu)自Sigma公司；CPV單克隆抗體購(gòu)自北京金百奧生物技術(shù)有限公司；胎牛血清購(gòu)自BIOCHROM公司；NAbTM純化柱購(gòu)自GE公司；6～8周齡SPF BALB/c小鼠購(gòu)自北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 動(dòng)物免疫

將CPV接種于生長(zhǎng)狀態(tài)良好的F81細(xì)胞，進(jìn)行CPV的擴(kuò)增培養(yǎng)，4～5 d當(dāng)細(xì)胞病變(CPE)達(dá)到80%時(shí)收取細(xì)胞培養(yǎng)上清病毒液并將其反復(fù)凍融3次。將收取的500 mL病毒液通過超速離心濃縮到5 mL，作為免疫小鼠的免疫原。

初次免疫為CPV與完全弗氏佐劑等量混合乳化，腹腔注射0.2 mL/只。二免、三免為CPV與不完全弗氏佐劑乳化，劑量與初次免疫劑量相同，時(shí)間間隔2周，三免7 d后斷尾采血，采用間接ELISA檢測(cè)小鼠血清效價(jià)。將效價(jià)高的小鼠融合前3 d用CPV腹腔注射0.2 mL/只加強(qiáng)免疫。

1.3 間接ELISA篩選方法的建立

以純化濃縮的CPV作為包被抗原，未免疫小鼠血清作為陰性對(duì)照，免疫小鼠血清作為陽(yáng)性對(duì)照，優(yōu)化間接ELISA反應(yīng)條件，建立間接ELISA篩選方法。

1.4 細(xì)胞融合與培養(yǎng)

取加強(qiáng)免疫后小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞在50% PEG的作用下進(jìn)行細(xì)胞融合，融合后接種于飼養(yǎng)層細(xì)胞中，在37 ℃、5% CO2的條件下用HAT培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性培養(yǎng)。

1.5 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選及亞克隆

利用間接ELISA方法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，直至能篩選到穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株，將其擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。

1.6 MAb腹水制備及抗體純化

將滅菌石蠟油以0.5 mL/只的劑量注射10周齡雌性BALB/c小鼠，7 d后腹腔注射陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞約5×106個(gè)，待小鼠腹腔明顯脹大后收集腹水，離心收集上清，采用親和層析方法純化腹水，SDS-PAGE鑒定純化抗體純度。

1.7 MAb的中和活性鑒定

將病毒濃度稀釋到200TCID50，與3株單抗倍比稀釋的腹水、細(xì)胞上清等體積混合，37 ℃、5% CO2的條件下孵育1 h，然后接種F81細(xì)胞，100 μL/孔，做4個(gè)平行重復(fù)，同時(shí)設(shè)置只加培養(yǎng)基、只加病毒液的細(xì)胞孔作為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，培養(yǎng)4～5 d觀察細(xì)胞的CPE情況，檢測(cè)MAb的中和活性。

1.8 MAb的鑒定

1.8.1 效價(jià)的測(cè)定

采用間接ELISA方法分別測(cè)定雜交瘤細(xì)胞上清、單克隆抗體腹水的抗體效價(jià)。

1.8.2 染色體數(shù)目的測(cè)定

在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞中加入秋水仙素溶液，使其終濃度為0.4 μg/mL，37 ℃培養(yǎng)4～6 h，離心棄上清，0.075 mol/L KCl低滲處理細(xì)胞30 min，經(jīng)固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)反復(fù)固定離心后，留取0.5～1 mL固定液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液滴在預(yù)冷載玻片上，10% Giemsa染液染色，鏡檢進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)。

1.8.3 亞型鑒定

按照免疫球蛋白分型檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行MAb亞類測(cè)定。

1.8.4 間接免疫熒光鑒定(IFA)

將CPV接種至單層F81細(xì)胞中，37 ℃培養(yǎng)24 h，經(jīng)甲醛固定細(xì)胞，Triton X-100處理后，加入單克隆抗體腹水(1∶1 000)37 ℃孵育1 h，洗滌后加入山羊抗小鼠FITC-IgG(1∶250)37 ℃避光孵育2 h。同時(shí)設(shè)立未接種CPV的細(xì)胞作為陰性對(duì)照，以商品化CPV單克隆抗體孵育接種CPV的細(xì)胞當(dāng)作陽(yáng)性對(duì)照，熒光顯微鏡觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.8.5 MAb抗病毒蛋白的鑒定

將本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的pCI-NS和pCI-VP1表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染F81細(xì)胞，37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)24 h，以1D9、3G9和4F6的細(xì)胞培養(yǎng)上清作為一抗，山羊抗小鼠FITC-IgG作為二抗進(jìn)行IFA檢測(cè)，同時(shí)設(shè)立以轉(zhuǎn)染空載體pCI-Neo的細(xì)胞孔作為陰性對(duì)照，測(cè)定雜交瘤細(xì)胞株具體識(shí)別的CPV蛋白種類。

1.8.6 交叉反應(yīng)性分析

將犬瘟熱病毒(CDV)、犬冠狀病毒(CCV)、犬腺病毒2型(CAV2)和CPV分別包被酶標(biāo)板，分別以相應(yīng)的陰性、陽(yáng)性血清作為陰、陽(yáng)性對(duì)照驗(yàn)證病毒是否包板成功。以本研究獲得的單克隆抗體作為一抗進(jìn)行間接ELISA，判定單克隆抗體與常見病毒的交叉反應(yīng)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 間接ELISA檢測(cè)方法的建立

經(jīng)過反應(yīng)條件的優(yōu)化，最終確定最佳的抗原包被濃度為 1∶100稀釋，37 ℃包被2 h；一抗反應(yīng)條件為1∶100倍稀釋，37 ℃反應(yīng)1 h；IgG-HRP反應(yīng)條件為1∶5 000稀釋，37 ℃避光反應(yīng)45 min；底物最佳反應(yīng)時(shí)間為10 min。

2.2 亞類鑒定

經(jīng)過3次亞克隆，獲得3株單抗，分別命名為1D9、3G9和4F6。亞類鑒定結(jié)果顯示，1D9和3G9重鏈為IgG1，4F6重鏈為IgG2b，輕鏈均為kappa鏈。

2.3 腹水抗體的純化

將純化的抗體進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖1，抗體重鏈大小為50 kDa左右，輕鏈大小為25 kDa左右。

M.預(yù)染蛋白Marker；1.1D9；2.3G9；3.4F6

2.4 效價(jià)測(cè)定

1D9、3G9和4F6單抗細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)分別為1∶64、1∶64和1∶128，腹水效價(jià)為1∶104、1∶104和1∶105。

2.5 染色體計(jì)數(shù)

1D9、3G9和4F6染色體數(shù)分別為92、94和98(如圖2)，均接近脾細(xì)胞(40)與骨髓瘤細(xì)胞(68)的染色體數(shù)目之和，表明本研究制備的3株單抗是2種細(xì)胞融合的產(chǎn)物。

A.1D9雜交瘤細(xì)胞；B.3G9雜交瘤細(xì)胞；C.4F6雜交瘤細(xì)胞

2.6 間接免疫熒光試驗(yàn)

本試驗(yàn)制備的3株單抗均可與感染CPV的F81細(xì)胞反應(yīng)，出現(xiàn)綠色熒光(如圖3)，與陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果一致，而與未接種CPV的F81細(xì)胞不發(fā)生反應(yīng)。

A.1D9與感染CPV的F81細(xì)胞反應(yīng)；B.3G9與感染CPV的F81細(xì)胞反應(yīng)；C.4F6與感染CPV的F81細(xì)胞反應(yīng)；D.陰性對(duì)照；E.陽(yáng)性對(duì)照。標(biāo)尺=400 μm

2.7 MAb的病毒蛋白識(shí)別分析

將pCI-NS、pCI-VP1表達(dá)質(zhì)粒以及空載體pCI-Neo分別轉(zhuǎn)染F81細(xì)胞，進(jìn)行IFA檢測(cè)，結(jié)果顯示如圖4。轉(zhuǎn)染了pCI-VP1細(xì)胞孔均能看到綠色熒光，而3株單抗與轉(zhuǎn)染了pCI-NS和空載體的細(xì)胞孔均無(wú)綠色熒光出現(xiàn)，表明雜交瘤細(xì)胞株1D9、3G9和4F6產(chǎn)生的單克隆抗體針對(duì)的是CPV的VP蛋白。

A.1D9與轉(zhuǎn)染pCI-VP1的F81反應(yīng)；B.1D9與轉(zhuǎn)染pCI-NS的F81反應(yīng)；C.1D9與轉(zhuǎn)染pCI-Neo的F81反應(yīng)；D.3G9與轉(zhuǎn)染pCI-VP1的F81反應(yīng)；E.3G9與轉(zhuǎn)染pCI-NS的F81反應(yīng)；F.3G9與轉(zhuǎn)染pCI-Neo的F81反應(yīng)；G.4F6與轉(zhuǎn)染pCI-VP1的F81反應(yīng)；H.4F6與轉(zhuǎn)染pCI-NS的F81反應(yīng)；I.4F6與轉(zhuǎn)染pCI-Neo的F81反應(yīng)。標(biāo)尺=400 μm

2.8 特異性試驗(yàn)

包被CDV、CCV、CAV和CPV的酶標(biāo)孔與相應(yīng)的陰、陽(yáng)性血清反應(yīng)后，P/N均大于2.1，說明病毒已成功包被。間接ELISA結(jié)果(表1)顯示，3株單抗只與CPV發(fā)生反應(yīng)，與CDV、CCV和CAV2均不發(fā)生反應(yīng)，證明本研究制備的單克隆抗體與其他犬類病毒無(wú)交叉反應(yīng)，特異性良好。

表1 交叉反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

2.9 MAb的中和活性鑒定

中和試驗(yàn)結(jié)果表明，雜交瘤細(xì)胞株4F6細(xì)胞上清稀釋16倍、腹水稀釋512倍時(shí)細(xì)胞未出現(xiàn)CPE，將其繼續(xù)稀釋時(shí)，出現(xiàn)CPE。雜交瘤細(xì)胞株4F6細(xì)胞培養(yǎng)上清完全中和效價(jià)為1∶16，腹水完全中和效價(jià)為1∶512。而1D9和3G9分泌的抗體不能阻止細(xì)胞發(fā)生CPE，不具有中和活性。

3 討論

單克隆抗體作為現(xiàn)代免疫學(xué)的重要工具之一，已廣泛應(yīng)用于病原檢測(cè)、治療、致病機(jī)制及抗原性研究等方面[8]。單克隆抗體制備的整個(gè)過程涉及到動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、篩選等多個(gè)步驟。免疫環(huán)節(jié)是單抗成功制備的關(guān)鍵[9]。免疫原的純度直接影響免疫效果，高純度的抗原可以提高雜交瘤細(xì)胞的陽(yáng)性率，有利于獲得所需的抗體。本研究采用純化濃縮的CPV作為免疫原進(jìn)行免疫，共獲得3株效價(jià)較高、特異性較好的單克隆抗體。而且其中1株具有中和活性，具有中和活性抗體的獲得可能與免疫原的純化有關(guān)。

目前對(duì)于患病動(dòng)物的治療臨床上主要采用高免血清或單克隆抗體進(jìn)行治療。相比于高免血清，單克隆抗體具有效價(jià)高、特異性好、可以規(guī)模化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)病毒感染的針對(duì)性治療具有較好的實(shí)用價(jià)值[10]。本研究獲得的單克隆抗體4F6具有中和活性，可應(yīng)用于疾病的治療。在診斷方面，常用的實(shí)驗(yàn)室診斷方法雖然敏感特異，但需要專業(yè)人員的專業(yè)操作，不適用于臨床診斷中[11]。膠體金檢測(cè)技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速、直觀等優(yōu)點(diǎn)。王中力等[12]利用膠體金溶液標(biāo)記已純化的CPV單克隆抗體，組裝膠體金免疫層析試紙條，檢測(cè)樣品效果良好。本研究制備的3株單克隆抗體亞類鑒定均屬于IgG類，將有利于膠體金標(biāo)記抗體和質(zhì)控線包被抗體的選擇，為建立相應(yīng)的免疫學(xué)檢測(cè)方法提供了基礎(chǔ)。