章金強，崔少庸，潘朝陽

（江西省萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院胸心大血管外科，萍鄉(xiāng) 337000）

據(jù)統(tǒng)計世界各地每年因肺癌死亡的人數(shù)在150 萬左右[1,2]，大部分患者確診時已處于中晚期，5年生存率不足20%[3]，其發(fā)病機制尚不明確，肺癌的發(fā)生和發(fā)展不僅與腫瘤細胞自身有關(guān)， 還與腫瘤、與機體各系統(tǒng)，尤其是免疫系統(tǒng)的互相作用有關(guān)， 腫瘤宿主的免疫能力下降是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和發(fā)展的一個重要原因[4]。 細胞凋亡是機體維持細胞死亡和細胞增殖的動態(tài)平衡， 避免細胞增生過度和維持機體穩(wěn)定狀態(tài)的一個重要機制， 若這一平衡失調(diào)，細胞則會增殖過度，從而導(dǎo)致腫瘤。 但是當(dāng)前并不明確凋亡的作用機制， 認(rèn)為是多基因參與調(diào)控以及多種抑制和促進因素互相作用的結(jié)果， 包括 TGF-Bl、e-myc、p53、Bel-2 家族、FasL 以及 Fas(脂肪酸合成酶)等[5]。 因此，本研究對 Fas 基因甲基化與肺癌組織中Fas、mRNA 以及Fas 蛋白表達的相關(guān)性進行了探討，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院2017 年2 月-2019 年5月期間收治的肺癌患者85 例為研究對象，再選擇經(jīng)手術(shù)治療的非肺癌患者70 例為對照組。 對照組年齡 39-70 歲，平均（54.6±9.3）歲，女 30 例，男 40例；觀察組年齡 48-75 歲，平均（61.4±12.5）歲，女40 例，男 45 例，其中 35 例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，50 例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移， 病理分型：18 例為小細胞肺癌，67 例為非小細胞肺癌。 兩組的性別、年齡等資料無可比性（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 抗體和試劑 選擇美國Maxim 公司生產(chǎn)的鏈霉菌抗生物素蛋白/過氧化物歧化酶免疫組織染色試劑盒、兔抗人FasL、Fas 多克隆抗體。

1.2.2 DNA 甲基化修飾 選用EZ DNA Methylation-GoldTM Kit (型號BTT3-D5005)行甲基化修飾。步驟嚴(yán)格按照說明書進行，具體步驟如下：

試 劑 盒 內(nèi) 容 ：CT Conversion Reagent、M -Dilution Buffer、M -Dissovlving Buffer、M -Binding Buffer、M-Wash Buffer、M-Desulphonation Buffer、M -Elution Buffer、Zymo -SpinTM IC Columns、Collection Tubes。

(1)CT Conversion Reagent 的 制 備 ： ①添 加900μl 雙蒸水、50μl M-Dissolving Buffer 和 300μl M-Dilution Buffer 到一個 CT Conversion Reagent管中。 ②在室溫下溶解并且震蕩10min，使用前室溫下避光保存。 CT Conversion Reagent 制備好后立即使用。

(2)M-wash buffer 的制備： 添加 24ml 100%的乙醇到6ml M-wash buffer 中來制備最終可以使用的M-wash buffer。

(3) 在 PCR 管中添加 130μl 的 CT Conversion Reagent 到每 20μl DNA 樣品中。

(4)將樣品管放到循環(huán)變溫器并按以下步驟操作:①98°C 放置 10min；②64°C 放置 2.5h；③立刻進行下述操作。

(5)添加 600 μl 的 M-Binding Buffer 到 Zymo-Spin ICTM Column 中， 并將柱放入試劑盒所提供的Collection Tube 中。

(6)裝填樣品到 Zymo-Spin ICTM Column（含有M-Binding Buffer）中。蓋上蓋將柱顛倒數(shù)次來混合樣品。

(7)全速 (≥10000rpm)離心 30s，去除流出液。(8)添加 100μl 的 M-Wash Buffer 到柱中。 全速離心30s。

(9)添加 200μl 的 M-Desulphonation Buffer 到柱中并且在室溫 (20°C-30°C) 下放置 20min。 在培養(yǎng)后,全速離心30s。

(10) 添加 200μl 的 M-Wash Buffer 到柱中。 全速離心 30s。 再添加 200μl 的 M-Wash Buffer 并且離心30s。

(11) 將柱放置在1.5ml 的離心管中, 直接添加10μl 的 M-Elution Buffer 到柱基質(zhì)中。 全速離心30s 來洗脫 DNA。 DNA 立刻進行 PCR。

1.2.2.1 PCR 擴增 PCR 引物參考本人研究生階段E-鈣黏附素基因甲基化在食管癌中的研究方案進行，由Invitrogen(上海)貿(mào)易有限公司合成。

總反應(yīng)體系為20μl，具體如下：

PCR 反應(yīng)體系

37℃水浴1h，孵育后的DNA 再進行甲基化修飾后進行PCR 擴增。PCR 反應(yīng)體系

(1)進行PCR 擴增，操作步驟嚴(yán)格按照試劑說明書進行，總PCR 反應(yīng)體系為25μl，具體如下表：

(2)PCR 循環(huán)：

采用PCR 擴增儀進行PCR 循環(huán)，具體步驟如下：

PCR 反應(yīng)體系

(3)PCR 產(chǎn)物電泳

采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，具體步驟如下：用微量加樣器取10μl PCR 產(chǎn)物小心點樣于1.5%瓊脂糖凝膠上， 電泳槽內(nèi)1×TAE 電泳緩沖液要完全浸沒瓊脂糖凝膠表面， 以ddH2O 替代模板DNA為空白對照，100bp DNA Ladder marker 作為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，80V、52mA 穩(wěn)壓電泳30min 后凝膠成像分析儀（UV-3A）觀察結(jié)果并拍照。

(4)PCR 電泳結(jié)果分析

同一樣本DNA 均需經(jīng)歷甲基化特異性引物（M）和非甲基化特異性引物（U）擴增，擴增結(jié)果會出現(xiàn)以下兩種結(jié)果：①甲基化特異性引物（M）擴增出目的條帶，非甲基化特異性引物（U）未擴增出目的條帶，即為Fas 基因完全甲基化；②甲基化特異性引物（M）未擴增出目的條帶，非甲基化特異性引物（U）擴增出目的條帶，即Fas 基因甲基化陰性。①屬于甲基化，②則屬于非甲基化。

運用免疫組化S-P 染色法，操作如下：①常規(guī)石蠟切片脫蠟至水后，在室內(nèi)溫度下，運用3%甲醇-H2O2溶液進行 10min 孵育后， 在 PBS 下洗5min；②修復(fù)抗原并封閉抗體，將比例適當(dāng)?shù)南♂尩囊豢够蛞豢构ぷ饕旱稳耄?將生物素標(biāo)記二抗100μl 滴入，在 37℃條件下進行 20min 孵育，運用PBS 液進行 3 次沖洗； ③將 100μl 鏈親和素-過氧化物酶溶液加入，覆滿全片，在37℃下進行20min孵育，PBS 沖洗 5min×3 次； ④DAB 發(fā)色， 終止水洗。 運用Maryer 蘇木精復(fù)染，脫水透明后，運用中性樹膠進行封片； ⑤用非轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織/正常肺組織在同一條件下染色為陽性對照組， 而陰性對照則由PBS 代替一抗； ⑥運用高倍顯微鏡進行觀察并照相。 同時運用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）對淋巴結(jié)組織、癌旁組織以及肺癌組織的Fas mRNA 表達進行檢測。

圖為擴增結(jié)果

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn) Fas 蛋白陽性染色標(biāo)準(zhǔn)以細胞質(zhì)或細胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為主。 同時，將腫瘤組織細胞的染色強度和染色率作為基本依據(jù)進行判斷：①陰性 （-）： 整張切片偶有棕黃色細胞或均無著色，且細胞數(shù)＜25%；②強陽性（2+）：腫瘤組織陽性染色細胞數(shù)≥75%，且表現(xiàn)為棕黃色；③陽性（+）：腫瘤組織陽性染色細胞數(shù)≥25%，且表現(xiàn)為淺棕黃色[6]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 本次研究數(shù)據(jù)由SPSS20.0 軟件分析，運用Fisher’s 確切概率法或卡方檢驗，通過Spearman 等級相關(guān)分析或單因素方差分析等級資料，以P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 肺癌組織和癌旁組織的各項指標(biāo)比較 正常肺組織和癌旁組織相比， 肺癌組織的Fas 蛋白和Fas mRNA 陽性表達率均較低，比較有差異（P＜0.05）； 但是癌旁組織和正常肺組織的Fas mRNA 和Fas 蛋白表達陽性率比較無差異（P＞0.05）；同時，正常肺組織和癌旁組織相比，肺癌組織的Fas 基因甲基化率較高，比較有差異（P＜0.05）。 見表1。

2.1.1 肺癌患者Fas mRNA 和Fas 蛋白表達與Fas基因甲基化狀態(tài)的相關(guān)性分析 經(jīng)Spearman 等級相關(guān)性分析，F(xiàn)as 蛋白和Fas mRNA 表達與Fas 基因甲基化呈反比關(guān)系 （r=-0.468，r=-0.472，P＜0.05）。

2.2 肺癌各亞型組織中各項指標(biāo)對比 正常肺組織的Fas mRNA 和Fas 蛋白表達陽性率均高于小細胞肺癌和非小細胞肺癌（P＜0.05）；非小細胞肺癌的Fas mRNA 和Fas 蛋白表達陽性率均高于小細胞肺癌（P＜0.05），但是Fas 基因甲基化率低于小細胞肺癌組（P＜0.05）。 見表2。

2.3 淋巴結(jié)組織中的各項指標(biāo)對比 轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的Fas mRNA 和Fas 蛋白表達陽性率均低于非轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)（P＜0.05），但 Fas mRNA 表達率和 Fas 蛋白陽性率均高于轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)（P＜0.05）。 見表3。

3 討論

通常情況下,細胞的凋亡途徑有3 種,分別是內(nèi)源性凋亡途徑、外源性凋亡途徑和細胞凋亡引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑,其中線粒體途徑又稱內(nèi)源性凋亡途徑，F(xiàn)as/FasL 介導(dǎo)的死亡受體途徑就稱為外源性途徑[7]。 Fas 蛋白又稱為 Apo-1 或 CD95，屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)/神經(jīng)生長因子受體(NGFR)家族成員,存在于多種組織細胞之中[8]。大多數(shù)研究表明Fas 蛋白分子中至少有3 個與凋亡誘導(dǎo)功能密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)域：EXT、“死亡” 域和調(diào)控區(qū)[9]。Fas 作為一個細胞凋亡信號受體，能通過與其配體FasL 結(jié)合而誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡[10]。 Fas 與 FasL 相互作用在誘導(dǎo)細胞凋亡中起關(guān)鍵作用,含有Fas 的細胞和Fas L 相互作用時,凋亡細胞即死亡[11]。有研究發(fā)現(xiàn)， 在大多數(shù)腫瘤細胞中，F(xiàn)as 表達下降，而FasL 表達增加[12],腫瘤微環(huán)境中免疫效應(yīng)細胞凋亡,直接或間接促進了腫瘤逃避機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，從而有利于腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，這也為腫瘤的治療提供了可能的途徑[13]。有文獻報道,Fas 基因表達受甲基化調(diào)控[14]， Petak 等發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌患者癌組織細胞中Fas 基因增強子區(qū)域DNA 甲基化，降低了Fas 蛋白的表達并且抑制了Fas 介導(dǎo)的細胞凋亡[15]。 Fas 基因甲基化水平升高是誘發(fā)Fas 缺失或表達下降的一個重要原因[16]。 本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)as基因甲基化與Fas 和Fas mRNA 蛋白表達呈反比關(guān)系（P<0.05），提示Fas 基因高甲基化能夠使這一基因失活導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制而不能正常轉(zhuǎn)錄,并且這一基因的轉(zhuǎn)錄水平隨著Fas 基因甲基化水平的升高而明顯下降， 從而加重Fas 蛋白表達的下調(diào)程度。此外，F(xiàn)as 蛋白的異常低表達,使腫瘤細胞無法正常進行細胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤細胞出現(xiàn)失控性生長，從而升高癌癥的發(fā)生概率。

表1 不同組織的Fas 蛋白、Fas mRNA 表達以及Fas 基因甲基化比較

表2 肺癌不同亞型組織中的臨床指標(biāo)比較

表3 淋巴結(jié)組織中的臨床指標(biāo)比較

綜上所述，肺癌組織呈現(xiàn)出Fas 基因高甲基化和Fas 表達下調(diào)的特點， 而在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中，F(xiàn)as基因呈高甲基化，F(xiàn)as 表達下調(diào)， 而Fas 基因甲基化能夠作為早期診斷肺癌的一個有效指標(biāo)， 可以為肺癌的靶向治療提供有效依據(jù)，值得推廣。