朱小華 ，鄒霞 ，殷俊翔 ，黃長文 ，李洪生 ，饒雪峰

（1.江西省人民醫(yī)院，南昌 330006；2.江西省婺源縣人民醫(yī)院，婺源 333200）

原發(fā)性肝細(xì)胞癌 ( hepatocellular carcinoma，HCC，簡稱肝癌) 是我國常見的惡性腫瘤之一。 我國HCC 占全球發(fā)病的40%以上，且近年來發(fā)病率有增高趨勢。激肽釋放酶9(KLK9)是激肽釋放酶基因家族的一個(gè)新成員，在人類染色體19q13.4 位置上，KLK9 基因由 5 個(gè)編碼蛋白的外顯子， 以及4個(gè)將其分隔的內(nèi)含子組成。 編碼 KLK9 蛋白的基因區(qū)域是由753bp 個(gè)堿基形成， 編碼了一個(gè)預(yù)計(jì)分子量為27.5kDa 的多肽；研究發(fā)現(xiàn)KLK9 基因高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。 本課題組前期研究[1]發(fā)現(xiàn)KLK9 在肝癌組織中過表達(dá)，并與肝癌的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性；本實(shí)驗(yàn)利用siRNA 干擾技術(shù)，進(jìn)一步觀察抑制KLK9 基因?qū)Ω伟┘?xì)胞MHCC97H增殖、侵襲轉(zhuǎn)移的影響。

1 材料與方法

1.1 引物設(shè)計(jì)在 GeneBank 基因庫中查 KLK9,GAPDH 的基因序列，并用Oligo7 軟件來設(shè)計(jì)分析KLK9(RT-PCR),GAPDH 的引物，并由上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)公司合成。 正鏈引物5’-CGCCAATGACC ACAATGATGA3’，負(fù)鏈引物：5’-CCAGCCTGAGAT GAGACACT3’， 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 長 度 為 133bp； 內(nèi) 參GAPDH 上游引物為 5’-CCCACTCCTCCACCTTTG AC3’，下游引物為 5’-TCTTCCTCTTGTGCTCTTGC-3’，產(chǎn)物大小為 182bp。

1.2 細(xì)胞的培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株 MHCC97H 購自上海細(xì)胞庫， 細(xì)胞用含有10%滅活胎牛血清的RMPI-DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)， 細(xì)胞置于 37 ℃，5%CO2孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)； 待細(xì)胞融合率達(dá)到70%-80%時(shí)，用胰酶消化細(xì)胞，終止消化，離心之后鋪板；6 孔板中，每孔 5×106，待細(xì)胞融合率達(dá)到 90%，加入1ml trizol 裂解細(xì)胞。

1.3 轉(zhuǎn)染KLK9-siRNA 購自 Dharmacon (Lafayette,CO, USA)，轉(zhuǎn)染前 1d，將 1.0×105個(gè)對數(shù)期生長的細(xì)胞接種于24 孔培養(yǎng)板，1ml／孔，培養(yǎng)過夜；次日按照Lipofectamine@RNAi MAX 轉(zhuǎn)染試劑操作說明,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞。 轉(zhuǎn)染分組如下：空白對照、雜序?qū)φ战M和siRNA-KLK9 轉(zhuǎn)染組。

1.4 實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測各組細(xì)胞目的基因的mRNA 表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染48h后收集實(shí)驗(yàn)所有細(xì)胞，Trizol 法提取總RNA， 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 后， 以其為模板， 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 5min，變性95℃ 30s，退火 59℃ 15s，延伸 72℃ 30s，循環(huán) 35 次。 反應(yīng)總體系 20μl,2x real-time PCR mix 10μl，上下游引物各1μl，cDNA 1μl,去離子水 7μl；在 PE5700 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀器上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增。 實(shí)驗(yàn)中每個(gè)樣品重復(fù)3 次，KLK9mRNA 的表達(dá)量采用相對定量法計(jì)算，其相對表達(dá)量=2-△△Ct，其中△Ct=目的基因 mRNA 的 Ct 值-內(nèi)參 Ct 值。

1.5 Western blot 分別提取各組細(xì)胞的總蛋白并用 BCA 法定量，SDS-PAGE 電泳分離， 轉(zhuǎn) PVDF膜，置于5%脫脂奶粉封閉1h，分別孵育于KLK9，p-ERK，VEGF 和 GAPDH 等兔單抗 （Santa Cruz Biotechnology 公司）（1:4000）中，4 ℃的冰箱中孵育過夜；TBST 洗膜后加入二抗 （羊抗兔）（Santa Cruz Biotechnology 公司）（1:5000），在室溫下，置于搖床上緩慢搖動孵育l h，TBST 洗膜后用ECL 法顯影，然后通過Quenity one 軟件進(jìn)行結(jié)果分析； 以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6 CCK-8 檢測細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 收集各組細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為3×104/ml，以每孔 100μl 接種于 96 孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于 24、48、72 和 96h 進(jìn)行 CCK-8法檢測，加入 CCK-8 液體 10μl，繼續(xù)培養(yǎng) 2h 后，酶標(biāo)儀490nm 波長檢測光密度值（OD）。

1.7 細(xì)胞劃痕 ⑴鋪板： 在六孔板背面畫3 條直線，待細(xì)胞融合率到達(dá)80%左右，并且細(xì)胞狀態(tài)良好，消化細(xì)胞，收集離心棄上清，用1ml DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，向6 孔板中接種細(xì)胞，每孔1×105個(gè)細(xì)胞。 ⑵劃痕：垂直于事先畫好的直線，用中槍頭在孔板里細(xì)胞上劃痕。 棄掉培養(yǎng)基，用PBS吸掉漂浮的細(xì)胞。 加入血清培養(yǎng)基 (10% FBS DMEM)；這時(shí)候立即用顯微鏡拍照，即為0 h。 然后持續(xù)觀察與記錄細(xì)胞遷移情況。

1.8 Transwell 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染72h 后消化細(xì)胞并重懸于無血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中制成細(xì)胞懸液。 將各組細(xì)胞分別按1×104個(gè)/孔加入Transwell 小室中的上室， 下室加入500UL 含10%FBS 的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h，培養(yǎng)結(jié)束后用棉簽輕擦去上室膜上表面的細(xì)胞， 位于下表面的侵襲細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，1%結(jié)晶紫染色， 風(fēng)干；200 倍的倒置顯微鏡下拍照，任意取6 個(gè)視野計(jì)算細(xì)胞數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用GraphPad Prism version 5.01 軟件進(jìn)行 One-way ANOVA （Tukey's Multiple Comparison Test） 檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA 干擾 KLK9 基因?qū)?KLK9mRNA 和蛋白的表達(dá)水平影響 結(jié)果，siRNA 干擾KLK9 基因后，KLK9mRNA 和蛋白表達(dá)水平在肝癌細(xì)胞MHCC97H 中明顯降低，P<0.0001（見圖1 和表1）。(GAPDH:37KDa, KLK9:27.5KDa)

2.2 Western blot 檢測 siRNA 干擾 KLK9 基因?qū)Ω伟┘?xì)胞p-ERK 和VEGF 蛋白的表達(dá)水平影響 結(jié)果 顯 示 ，siRNA 干 擾 KLK9 基 因 后 ，p-ERK 和VEGF 蛋白表達(dá)水平在 MHCC97H 細(xì)胞中明顯降低 （見圖2，3 和表2）。 (p-ERK:42/44KDa,VEGF:42KDa)

圖1 siRNA 干擾后KLK9 蛋白的表達(dá)水平

表1 siRNA 干擾后 KLK9mRNA 和 KLK9 蛋白的表達(dá)水平（±s）

表1 siRNA 干擾后 KLK9mRNA 和 KLK9 蛋白的表達(dá)水平（±s）

分組 KLK9 mRNA（2-△△Ct） KLK9 蛋白水平（KLK9/GAPDH）空白對照組雜序?qū)φ战M實(shí)驗(yàn)組1 F P 0.980±0.017 0.300±0.150 47.14 0.0002 0.887±0.097 0.865±0.081 0.126±0.020 112.1<0.0001

圖2 siRNA 干擾后MHCC97H 細(xì)胞中p-ERK 蛋白水平

圖3 siRNA 干擾后MHCC97H 細(xì)胞中VEGF 蛋白水平

表2 siRNA 干擾后 MHCC97H 細(xì)胞中 p-ERK 和 VEGF 蛋白水平（±s）

表2 siRNA 干擾后 MHCC97H 細(xì)胞中 p-ERK 和 VEGF 蛋白水平（±s）

分組 p-ERK 蛋白水平 VEGF 蛋白水平空白對照組雜序?qū)φ战M實(shí)驗(yàn)組F P 1.460±0.100 1.357±0.090 0.715±0.071 54.74 0.0001 0.829±0.046 0.816±0.069 0.578±0.047 20.46 0.002

2.3 CCK-8 檢測法檢測siRNA 干擾KLK9 基因?qū)Ω伟┘?xì)胞增殖的影響 結(jié)果顯示，siRNA 干擾KLK9 基因 96h 后，MHCC97H 肝癌細(xì)胞增殖能力明顯減弱，P<0.0001（見圖4 和表3）。

圖4 siRNA 干擾后MHCC97H 肝癌細(xì)胞增殖情況：通過CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)siRNA 轉(zhuǎn)染96 小時(shí)后，MHCC97H 肝癌細(xì)胞增殖能力較空白對照組和雜序?qū)φ战M顯著減弱，P＜0.0001

2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測siRNA 干擾KLK9 基因?qū)Ω伟┘?xì)胞遷移能力的影響 結(jié)果顯示，siRNA 干擾KLK9 基因后，MHCC97H 肝癌細(xì)胞遷移能力明顯減弱，P<0.05（見表4 和圖5）。

表3 siRNA 干擾后 MHCC97H 肝癌細(xì)胞增殖的影響（n=3，±s）

表3 siRNA 干擾后 MHCC97H 肝癌細(xì)胞增殖的影響（n=3，±s）

實(shí)驗(yàn)分組 OD 值（96h） F P空白對照組雜序?qū)φ战M實(shí)驗(yàn)組1.691±0.042 1.751±0.532 1.282±0.039 84.76 <0.0001

圖5 siRNA 干擾后MHCC97H 肝癌細(xì)胞遷移情況：通過劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)siRNA 轉(zhuǎn)染66 小時(shí)后，MHCC97H 肝癌細(xì)胞遷移能力較對照組顯著減弱，P＜0.01

表4 siRNA 干擾后 MHCC97H 肝癌細(xì)胞遷移能力（n=3，±s）

表4 siRNA 干擾后 MHCC97H 肝癌細(xì)胞遷移能力（n=3，±s）

分組 遷移率(%) F P空白對照組雜序?qū)φ战M實(shí)驗(yàn)組56.83±5.73 53.81±12.07 27.24±8.43 8.647 0.017

2.5 Transwell 檢測 siRNA 干擾 KLK9 基因?qū)Ω伟┘?xì)胞侵襲能力的影響 結(jié)果顯示，siRNA 干擾KLK9 基因后， MHCC97H 肝癌細(xì)胞侵襲能力明顯減弱，P<0.05（見表5 和圖6）。

圖6 siRNA 干擾后 MHCC97H 肝癌細(xì)胞侵襲情況：通過Transwell 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)siRNA 轉(zhuǎn)染后，MHCC97H 肝癌細(xì)胞侵襲能力較對照組顯著減弱，P＜0.01

表5 siRNA 干擾后 MHCC97H 肝癌細(xì)胞侵襲能力（n=3，±s）

表5 siRNA 干擾后 MHCC97H 肝癌細(xì)胞侵襲能力（n=3，±s）

分組 侵襲數(shù)(個(gè)) F P空白對照組雜序?qū)φ战M實(shí)驗(yàn)組103.46±11.41 97.24±8.76 62.51±4.49 12.29 0.007

3 討論

KLK9 基因在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，研究發(fā)現(xiàn)KLK9 高表達(dá)與某些類型的腫瘤密切相關(guān)。 Shinoda 等[2]通過 RT-PCR 技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)KLK9mRNA 在膀胱癌細(xì)胞株和組織中較正常膀胱細(xì)胞株和組織中表達(dá)升高。 包香香等[3]發(fā)現(xiàn) KLK9在惡性卵巢腫瘤中的陽性表達(dá)率高于良性及交界性腫瘤。 Memari 等[4]亦認(rèn)為KLK9 可能作為乳腺癌和卵巢癌重要標(biāo)志物。 而Geng X 等[5]通過 PCR 檢測發(fā)現(xiàn)KLK9 在大多數(shù)晚期高等級漿液性卵巢癌組織樣本中 mRNA 表達(dá)水平均較低， 且KLK9mRNA 表達(dá)水平與患者預(yù)后無明顯關(guān)聯(lián)性。Yousef 等[6]發(fā)現(xiàn)KLK9 在早期乳腺癌患者和小腫瘤患者中的表達(dá)會明顯升高，KLK9 陽性患者無病生存時(shí)間更長，總生存時(shí)間更長。 而 Drucker KL 等[7]發(fā)現(xiàn) KLK9 與高分化膠質(zhì)瘤有關(guān)， 并與不良預(yù)后有關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[1]：KLK9 蛋白質(zhì)在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于肝癌癌旁組織和正常肝組織中的表達(dá)；KLK9mRNA 在肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平較正常肝細(xì)胞表達(dá)明顯升高； 提示 KLK9基因與肝癌發(fā)生密切相關(guān)， 在肝癌的發(fā)生中起重要作用。Adamopoulos PG 等[8]對 17 種不同的人類癌組織(包括乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、大腸癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、肺腺癌等)中的KLK9基因進(jìn)行選擇性剪接轉(zhuǎn)錄及分子克隆， 并通過新一代測序技術(shù)發(fā)現(xiàn) KLK9 基因可作為診斷和/或預(yù)后的新候選生物標(biāo)志物，并作為治療策略的目標(biāo)。Shinoda 等[2]發(fā)現(xiàn)KLK9mRNA 在浸潤性膀胱癌中的表達(dá)高于淺表膀胱癌，KLK9 基因在膀胱癌中的表達(dá)與膀胱癌分期有關(guān)系,腫瘤分期晚，KLK9 表達(dá)水平越高, 并且通過 siRNA 干擾這些激肽釋放酶可以抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲力,認(rèn)為 KLK9 在促進(jìn)膀胱腫瘤癌細(xì)胞浸潤有重要的作用。 我們前期研究還顯示[1]： KLK9 蛋白質(zhì)的陽性表達(dá)率與腫瘤大小、分化程度、肝內(nèi)或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期均呈正相關(guān)性，KLK9 蛋白質(zhì)在大腫瘤、分化程度差、肝內(nèi)或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、 臨床分期晚的腫瘤中其陽性表達(dá)率更高。 本研究進(jìn)一步通過增殖、劃痕和侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，siRNA 干擾 KLK9 基因后， 肝癌細(xì)胞MHCC97H 增殖、遷移和侵襲能力明顯減弱，這說明抑制KLK9 基因，可抑制肝癌細(xì)胞MHCC97H 增殖、侵犯和轉(zhuǎn)移。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是一種細(xì)胞內(nèi)信號通路， 其生理功能包括細(xì)胞增殖、 凋亡和侵襲、轉(zhuǎn)移[9]。 細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號通路是 MAPK /ERK 信號通路的關(guān)鍵， 包括 ERK1 和ERK2，它通常位于細(xì)胞質(zhì)中。 P-ERK1/2（磷酸化ERK1/2）是ERK1/2 的激活形式，它將信號從表面受體傳遞到細(xì)胞核，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活動，產(chǎn)生細(xì)胞效應(yīng);它的異常表達(dá)在細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)展中起著重要的作用[10,11]。 目前 KLKs 家族中成員與ERK 信號通路調(diào)節(jié)關(guān)系研究報(bào)道不多，Cao XY 等[12]研究顯示抑制KLK10 基因表達(dá)可以通過抑制FAK-SRC-ERK 信號通路的激活， 從而降低胰腺導(dǎo)管腺癌的侵犯和轉(zhuǎn)移。 本研究發(fā)現(xiàn)，siRNA干擾 KLK9 基因后，p-ERK 蛋白表達(dá)水平在MHCC97H 細(xì)胞中明顯降低，MHCC97H 肝癌細(xì)胞增殖、 遷移和侵襲能力明顯減弱， 這提示了抑制KLK9 基因可降低肝癌細(xì)胞MHCC97H 增殖、遷移和侵襲的能力與p-ERK 的活性抑制相關(guān)。

腫瘤之所以能生長迅速必須依靠新生血管供給營養(yǎng)和排泄代謝產(chǎn)物， 同時(shí)通過新生血管轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞。 血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在腫瘤的血管形成中起重要作用[13,14],抑制VEGF 表達(dá)，可減少腫瘤新生血管，抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移[15,16]。 本研究亦發(fā)現(xiàn)，siRNA 干擾 KLK9 基因后，VEGF 蛋白表達(dá)水平在 MHCC97H 細(xì)胞株中明顯降低， MHCC97H肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯減弱， 這提示抑制KLK9 基因，可能通過抑制VEGF 表達(dá)，從而抑制肝癌細(xì)胞MHCC97H 遷移和侵襲能力。

總之， 抑制 KLK9 基因可降低肝癌細(xì)胞MHCC97H 增殖、 遷移和侵襲能力， 這可能與p-ERK 活性的抑制和VEGF 表達(dá)的降低相關(guān)； 這些提示了KLK9 基因可能作為肝癌靶向治療的新靶點(diǎn)，為肝癌基因治療提供新的思路和理論基礎(chǔ)。