朱昊俊，強(qiáng) 俊，陶易凡，包景文，陳德舉，徐 跑,

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇無錫 214081；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214081)

動物腸道微生物環(huán)境是由多種微生物構(gòu)成的復(fù)雜微生態(tài)系統(tǒng)，魚類腸道微生物與宿主在所處的水生環(huán)境下，會形成一個復(fù)雜的微生態(tài)系，這是動物長期進(jìn)化的結(jié)果。腸道微生物組成一方面具有相對穩(wěn)定性[1]，另一方面又具有宿主特異性[2]。腸道微生物在宿主體內(nèi)的定植與穩(wěn)態(tài)對宿主具有重要意義，其對宿主的營養(yǎng)代謝、免疫應(yīng)答、疾病狀態(tài)甚至行為均會產(chǎn)生影響[3-5]。腸道微生物來源于環(huán)境，同時受遺傳背景和食物等因素的影響，其與宿主之間的關(guān)系現(xiàn)在越來越受研究者們的關(guān)注。關(guān)于魚類腸道菌群的研究國外開展很早，研究涉及菌群的形成、種類、數(shù)量等[6-8]，以及腸道菌群對魚體正常生理理功能的調(diào)節(jié)作用[9]，而我國的研究側(cè)重點(diǎn)是在致病菌與腸道菌群的關(guān)系，疾病條件下腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)變化等[10,11]方面。本研究采用高通量測序技術(shù)對人工飼養(yǎng)環(huán)境下吉富羅非魚腸道微生物進(jìn)行分析，旨在了解羅非魚腸道微生物的結(jié)構(gòu)組成和不同腸道分段的差異，為深入研究羅非魚腸道菌群結(jié)構(gòu)，同時優(yōu)化養(yǎng)殖條件、預(yù)防疾病發(fā)生等提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 羅非魚腸道樣品獲取

試驗(yàn)用吉富羅非魚(Oreochromisniloticus)由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院宜興水產(chǎn)養(yǎng)殖基地繁殖，飼養(yǎng)于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院水產(chǎn)溫室內(nèi)，采用循環(huán)水養(yǎng)殖，每日定時(7:00時，16:00時)投喂顆粒飼料兩次。維持水溫(28±0.3)℃，溶氧>6 mg/L，pH 7.4～7.8，氨氮鹽<0.1 mg/L，亞硝酸鹽<0.01 mg/L。隨機(jī)選取在系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)90 d吉富羅非魚活體4尾，平均體重100 g，體長15 cm左右，麻醉后在無菌操作臺進(jìn)行解剖。取出整個腸道，用生理鹽水進(jìn)行洗滌，然后分別截取腸道靠近胃部(前段、IC1段)和靠近肛門部位(后段、IC2段)腸道放入凍存管，液氮冷凍后放入-80 ℃冰箱保存。

1.2 腸道微生物總DNA提取和測序

腸道樣本使用TIANGEN糞便提取試劑盒(DP328)提取腸道微生物總DNA，提取完畢后使用Nano Drop Lite微量核酸檢測儀進(jìn)行濃度測定。對16S rRNA基因v3-v4區(qū)域進(jìn)行微生物測序及信息分析采用通用引物338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。

對PCR產(chǎn)物采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega QuantiFluor熒光定量系統(tǒng)上對文庫進(jìn)行定量，合格的文庫濃度應(yīng)在2 nmol/L以上。將合格的各上機(jī)測序文庫(Index序列不可重復(fù))梯度稀釋后，使用MiSeq測序儀進(jìn)行2×300 bp的雙端測序，試劑為MiSeq Reagent Kit V3(600 cycles)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)Illumina MiSeq平臺雙端測序的重疊關(guān)系，將序列拼接(merge)成一條序列tags，同時過濾Reads的質(zhì)量和合并的效果。將序列相似度大于97%的相似序列聚類為OTU(Operational Taxonomic Units)。根據(jù)已有細(xì)菌和真菌的分類學(xué)數(shù)據(jù)庫將OTUs進(jìn)行分類和標(biāo)注，同時計(jì)算Alpha多樣性(observed_species，chao1，shannon，simpson)和Beta多樣性指數(shù)。

Alpha多樣性以及Beta多樣性均由 QIIME流程分析，圖片由R(v3.5.2)包繪制。采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)方法，分析了不同樣品間Alpha多樣性和相對豐度差異的顯著性。使用ADONIS分析Beta多樣性的差異顯著性。P<0.05是被認(rèn)為差異顯著。

2 研究結(jié)果

2.1 基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增情況

電泳檢測結(jié)果如圖1示。電泳圖DNA條帶明顯，使用超微量分光光度計(jì)檢測樣本OD值和濃度，樣品濃度≥120 ng/μL，OD 260 nm/280 nm 值在1.8～2.1。

圖1 腸道微生物宏基因組DNA質(zhì)量檢測

2.2 門水平上和屬水平上不同腸道分段微生物比較

由圖2可知，在門水平上優(yōu)勢種群是擬桿菌門(Bacteroidetes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、厚壁菌門(Firmicutes)和放線菌門(Actinobacteria)6個門，占到相對豐度的95%以上。對樣本中平均相對豐度大于1%的菌門進(jìn)行差異分析，如圖2b所示，梭桿菌門(22.71% vs 43.21%)和放線菌門(3.01% vs 0.77%)的相對豐度存在顯著差異。而擬桿菌門(41.90% vs 36.94%)、變形菌門(17.78% vs 5.62%)、疣微菌門(6.84% vs 9.51%)、厚壁菌門(5.97% vs 3.49%)沒有顯著差異。

圖2 門水平上腸道優(yōu)勢菌群

圖3可知，在屬水平上相對平均豐度大于1%的屬有8個，分別為鯨桿菌屬(Cetobacterium)、擬桿菌屬(Bacteroides)、石斑科-未分類(Porphyromonadaceae-unclassified)、阿克曼屬(Akkermansia)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、棲水菌屬(Enhydrobacter)、Romboutsia屬和鄰單胞菌屬(Plesiomonas)。其中鯨桿菌屬(22.71% vs 43.21%)相對豐度存在顯著差異。

圖3 屬水平上腸道優(yōu)勢菌群

2.4 Beta多樣性分析結(jié)果

基于weighted unifrac距離的PCoA分析結(jié)果如圖4所示，PC1貢獻(xiàn)度為59.86%，PC2貢獻(xiàn)度為21.31%。從圖中可以看出，不同腸道分段間樣本明顯區(qū)分，IC1段和IC2段樣品分別聚為一類，結(jié)果具有顯著差異。

圖4 PCoA分析2D示意圖(Weight_uniFrac)

2.3 Alpha多樣性分析結(jié)果

各樣品的Alpha多樣性計(jì)算結(jié)果見表2。根據(jù)方差分析結(jié)果可知，IC1分段和IC2分段物種數(shù)目、Chao1指數(shù)、辛普森指數(shù)和香農(nóng)-威納指數(shù)均存在顯著差異，IC1段的多樣性明顯要高于IC2段。

表2 樣品的多樣性指數(shù)

2.5 物種分類熱圖結(jié)果

如圖5所示，在門水平和屬水平上，不同腸道分段的微生物群落組成有所不同，從聚類分析上可以看出，IC1段和IC2段各自聚為一類，其組間差異明顯大于組內(nèi)差異。同時，IC1段的多樣性水平要高于IC2段，在靠前的20個門或?qū)兕悇e上，IC1段大部分的表達(dá)量明顯高于IC2段。

圖5 門水平和屬水平上物種分類熱圖

3 討論

本研究中，在門水平上相對平均豐度大于1%的優(yōu)勢菌門是擬桿菌門、梭桿菌門、變形菌門、疣微菌門、厚壁菌門和放線菌門。在不同的腸道段，優(yōu)勢菌門種類一致，但是在其相對豐度存在差異，其中梭桿菌門和放線菌門相對豐度存在顯著差異。在屬水平上，相對豐度大于1%的優(yōu)勢菌屬有8個，存在顯著差異的只有一個鯨桿菌屬(Cetobacterium)。Fan等[12]研究吉富羅非魚腸道與周圍水體內(nèi)微生物關(guān)系時發(fā)現(xiàn)羅非魚腸道門水平上優(yōu)勢種群是梭桿菌門、變形菌門和厚壁菌門。同時有研究指出魚類腸道中常見的微生物主要是厚壁菌門、變形菌門、假單胞菌門、不動桿菌門等[13,14]；擬桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬和梭桿菌屬是淡水魚的腸道優(yōu)勢內(nèi)源性菌群的主要種類[15]。本研究結(jié)果與相關(guān)研究結(jié)果部分一致，在優(yōu)勢菌群種類和豐度方面存在較大差異。導(dǎo)致腸道微生物組成改變的因素很多，不同的物種、飼料組成、性別、年齡、生存環(huán)境、甚至采樣和分析方法均可能導(dǎo)致菌群相對豐度的改變[16,17]。另外有報(bào)道指出厚壁菌門是大部分脊椎動物腸道中的優(yōu)勢菌群[18]，而在本研究中，厚壁菌門所占的比例較少，僅占相對豐度的5.97%(IC1段)和3.49%(IC2段)，導(dǎo)致這種差異的原因可能與不同品種以及不同生活環(huán)境有關(guān)，魚類腸道結(jié)構(gòu)比較簡單，其腸道菌群容易受到水質(zhì)和餌料影響[19]，具體原因需進(jìn)一步驗(yàn)證。

腸道內(nèi)的復(fù)雜菌群既可以代謝機(jī)體的營養(yǎng)物質(zhì)，又可以與機(jī)體代謝相互作用產(chǎn)生各種代謝物質(zhì)，其對營養(yǎng)素的代謝利用及其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物既能影響飼料營養(yǎng)素的高效利用，又能調(diào)控宿主的正常生理功能。擬桿菌門和厚壁菌門可以產(chǎn)生多糖水解酶，多糖水解酶可以有效降解膳食纖維進(jìn)而產(chǎn)生單糖和短鏈脂肪酸(SCFA)，是腸道內(nèi)壁細(xì)胞基本代謝的能量來源之一[20]，厚壁菌門和擬桿菌門的豐度也被研究者認(rèn)為是評價動物機(jī)體肥胖程度的重要指標(biāo)[21,22]。擬桿菌門和厚壁菌門均是本研究中羅非魚腸道的優(yōu)勢菌門，這些腸道菌群的定植對機(jī)體的營養(yǎng)吸收具有重要作用。變形菌門是細(xì)菌中最大的一門，廣泛存在于土壤、污水、動物以及植物體內(nèi)，包含一些無機(jī)化能和光合種類，同時也包括很多病原菌，如大腸桿菌、沙門氏菌、弧菌、假單胞菌等種類。變形菌門豐度的提高可能是腸道菌群失衡的一個重要標(biāo)志[23]。在本研究中，變形菌門在門水平上占有相對較高的豐度，其種類繁多，對宿主的作用比較復(fù)雜。梭桿菌門下的鯨桿菌屬是魚類腸道內(nèi)比較普遍的一類益生菌，被認(rèn)為具有發(fā)酵多肽碳水化合物的能力，代謝產(chǎn)生乙酸，少量產(chǎn)生丁酸、丙酸、乳酸和琥珀酸，同時與產(chǎn)維生素B12相關(guān)[24]，對魚類的營養(yǎng)吸收發(fā)揮重要的作用。目前腸道菌群和宿主免疫之間的關(guān)系是熱點(diǎn)領(lǐng)域之一，近年來的大量研究均表明，動物腸道微生物對宿主免疫功能的建立和維持起著重要的作用，但具體的調(diào)控機(jī)制仍在研究中。

魚類的腸道是機(jī)體重要的消化器官，腸道結(jié)構(gòu)相對簡單，由相似的細(xì)胞組成，沒有消化吸收功能上的嚴(yán)格分區(qū)。在大部分研究中，魚類的腸道一般被人為分成前中后三段[25,26]。本研究選取了前段和末段的腸道進(jìn)行研究。對比前后腸道分段發(fā)現(xiàn)，腸道IC1段和腸道IC2段的優(yōu)勢菌群種類基本一致，但是各優(yōu)勢種群的相對豐度存在差異。同時IC1段腸道的多樣性要顯著高于IC2段。反映生物多樣性的chao1指數(shù)、辛普森指數(shù)和香農(nóng)-威納指數(shù)均存在顯著差異，從物種分類熱圖也可以清晰的看出IC1段的多樣性要更為豐富。推測可能原因是魚類相對簡單的胃部結(jié)構(gòu)導(dǎo)致食物本身攜帶的一些微生物不會在胃部失去活性，進(jìn)而進(jìn)入腸道，從而影響羅非魚本身的微生物群體組成；同時，魚類腸道由前向后，其內(nèi)部蛋白酶、淀粉酶等主要消化酶的活性均逐漸下降。前部是羅非魚消化吸收的重點(diǎn)部位，也是消化腺體等集中部位，部分參與宿主消化吸收功能的微生物群體在前段的豐度要高于后段。