陸 星，吳 凡，文 華，劉 偉，田 娟，蔣 明，喻麗娟，梁宏偉

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢 430223)

中華鱉(Pelodiscussinensis)，俗稱(chēng)甲魚(yú)，隸屬脊椎動(dòng)物亞門(mén)爬行綱龜鱉目鱉科鱉屬，是我國(guó)重要的特種水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一[1]。據(jù)2019年中國(guó)漁業(yè)年鑒報(bào)道，全國(guó)鱉的養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到31萬(wàn)t以上。目前，中華鱉的養(yǎng)殖已逐漸從小規(guī)模的土池養(yǎng)殖進(jìn)入到集約的溫室養(yǎng)殖[2]。但集約化養(yǎng)殖過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)大量的應(yīng)激因子，如擁擠、環(huán)境惡化(包括溫度、氨氮、溶氧、亞硝酸鹽)等導(dǎo)致機(jī)體代謝異常，引起氧化應(yīng)激和免疫功能下降，從而造成其氧化損傷、生長(zhǎng)速度降低甚至引發(fā)病害。因此，運(yùn)用營(yíng)養(yǎng)調(diào)控手段，在飼料中添加抗氧化物質(zhì)提高中華鱉的生長(zhǎng)性能和抗氧化應(yīng)激能力，將對(duì)中華鱉的健康養(yǎng)殖產(chǎn)生積極作用。

谷胱甘肽(glutathione,GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸與甘氨酸結(jié)合而成的三肽活性物質(zhì)。作為真核細(xì)胞中重要的生物活性物質(zhì)，GSH在清除機(jī)體內(nèi)的自由基時(shí)起關(guān)鍵作用[3]。對(duì)畜禽的研究表明，飼料中添加適量的GSH可提高仔豬[4]和肉雞[5]的生長(zhǎng)性能和抗氧化能力。在水產(chǎn)養(yǎng)殖上，對(duì)GSH的研究主要集中于淡水和海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)。例如，趙紅霞等[6]報(bào)道，飼料中添加GSH可以提高草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)血清中胰島素生長(zhǎng)因子IGF-1的水平，并增強(qiáng)其非特異性免疫功能。羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)飼料中添加一定量的GSH能夠顯著提高其總抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)的活力[7]。王芳倩等[8]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加適量的GSH能夠增強(qiáng)牙鲆(Paralichthysolivaceus)的生長(zhǎng)和抗氧化能力。然而，關(guān)于GSH應(yīng)用在爬行類(lèi)的研究報(bào)道還較少。因此，本實(shí)驗(yàn)以中華鱉為研究對(duì)象，探討飼料中添加GSH對(duì)中華鱉生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)及肝臟超氧化物歧化酶基因表達(dá)的影響，以便為GSH在中華鱉飼料中的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料

以白魚(yú)粉、啤酒酵母和大豆?jié)饪s蛋白為蛋白源，豆油為脂肪源的基礎(chǔ)飼料，在其中分別添加0、100、200和400 mg/kg的GSH，并依次設(shè)置為G0(對(duì)照)、G100、G200和G400共4個(gè)試驗(yàn)組。還原型GSH購(gòu)自西安皓源生物技術(shù)有限公司，飼料中GSH的實(shí)測(cè)值分別為：0、96.57、184.11和367.93 mg/kg。各組飼料配方及營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。

表1 各組飼料配方及其基本營(yíng)養(yǎng)組成(干重)

1.2 試驗(yàn)魚(yú)和飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖試驗(yàn)在安徽喜佳農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司中華鱉養(yǎng)殖場(chǎng)的溫室進(jìn)行。試驗(yàn)前將雄性日本品系中華鱉馴養(yǎng)2周。結(jié)束后，選擇大小均勻、健康無(wú)病的雄性日本品系中華鱉(均重389.18 g±5.98 g)36只。試驗(yàn)鱉隨機(jī)分成4組，每組9只(3個(gè)平行，每個(gè)平行3只)，飼養(yǎng)于12個(gè)長(zhǎng)方形塑料箱(90 cm×60 cm×35 cm)中，箱中水深約25 cm，每個(gè)養(yǎng)殖箱中掛3塊網(wǎng)片，供中華鱉攀爬棲息，箱中設(shè)置一塊20 cm×30 cm的食臺(tái)，食臺(tái)設(shè)在水下2～3 cm。每天投喂6～8 mm左右的顆粒飼料，分三次投喂(8:30、13:30和18:30)，并留樣用于基礎(chǔ)飼料營(yíng)養(yǎng)成分分析。投喂量按其體重的1%，以20 min之內(nèi)吃完為宜。若觀察到有未食完餌料,收集烘干稱(chēng)重并記錄。每晚20:00用吸管清除養(yǎng)殖箱中糞便，并補(bǔ)充新水，每3 d換水一次。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)持續(xù)8周，飼養(yǎng)期間水溫控制在(32±1)℃。

1.3 樣品采集與分析

1.3.1 樣品采集

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，禁食24 h，稱(chēng)重并計(jì)算其增重率、飼料效率和肝體比。將中華鱉從頸動(dòng)脈處取血，制備血清；分離其背甲與腹甲，解剖取出肝臟并稱(chēng)重，用于計(jì)算肝體比，另取約0.2 g左右的肝組織放入液氮冷凍保存，用于基因表達(dá)分析。取四肢肌肉樣品，并儲(chǔ)存于-20 ℃冰柜，用于常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定。

1.3.2 生長(zhǎng)指標(biāo)計(jì)算

增重率(WGR)=100%×(Wt-W0)/W0

飼料效率(FE)=增重量/投飼量

肝體比(HSI)=100%×(肝臟重/體質(zhì)量)

式中：Wt為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)鱉的體質(zhì)量；W0為初始體質(zhì)量

1.3.3 常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定

水分含量檢測(cè)采用直接干燥法(GB/T 5009.3-2003)；粗蛋白含量檢測(cè)采用凱氏定氮法(GB/T 5009.5-2003)；粗脂肪含量檢測(cè)采用索氏抽提法(GB/T 5009.6-2003)；灰分含量測(cè)定采用灼燒稱(chēng)重法(GB/T 5009.4-2003)(中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)，食品衛(wèi)生檢測(cè)方法理化部分)。

1.3.4 血清生化指標(biāo)檢測(cè)

血清總膽固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、血糖(GLU)、總蛋白(TP)含量、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性采用日本希森美康全自動(dòng)生化分析儀(Sysmex,CHEMIX-800)測(cè)定，所用試劑均購(gòu)自Sysmex公司。

1.4 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和熒光定量 PCR(qPCR)

采用TRIZOL方法(Invitrogen，美國(guó))提取各組中華鱉肝臟組織的總RNA，并用RNase-free DNase I(Takara)去除殘余的DNA，取1 μL RNA樣品快速高壓電泳以檢測(cè)RNA完整性，用紫外分光光度計(jì)(Biophotometer Eppendorf)對(duì)RNA濃度進(jìn)行測(cè)定，按照Fermentas RevertAidTM First試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。

使用Applied Biosystems 7500實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行qPCR分析，熒光定量試劑SYBR Green Real Master Mix購(gòu)自天根生化科技有限公司。根據(jù)GenBank序列設(shè)計(jì)超氧化物歧化酶1(sod1)和超氧化物歧化酶2(sod2)基因的引物(采用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì))，同時(shí)選用中華鱉β-actin基因作為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表2。PCR反應(yīng)體系：2×SYBR Green Real Master Mix 10 μL，10 μmol/L的正、反向引物各0.4 μL，10倍稀釋的第一鏈cDNA樣品5 μL，超純水補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃，5 min；(95 ℃，10 s；60 ℃，30 s)，40個(gè)循環(huán)；然后每個(gè)循環(huán)增加1 ℃，從65 ℃升高到95 ℃進(jìn)行溶解曲線(xiàn)分析，各組反應(yīng)都重復(fù)3次。采用2-△△Ct方法計(jì)算各基因表達(dá)的變化倍數(shù)[9]。

表2 熒光定量PCR所用的引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件中one-way ANOVA方差分析和Duncan氏均值多重比較對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P<0.05時(shí)認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 飼料中添加GSH對(duì)中華鱉生長(zhǎng)性能的影響

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，各組的中華鱉存活率均為100%。由表3可知，添加GSH各組中華鱉的WGR和FE均高于G0組，且在G200組達(dá)到最大值(P<0.05)。而各組的HSI無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表3 飼料GSH水平對(duì)中華鱉生長(zhǎng)性能和飼料利用的影響

2.2 飼料中添加GSH對(duì)中華鱉肌肉營(yíng)養(yǎng)成分的影響

由表4可知，GSH添加組的粗蛋白和粗脂肪含量均高于G0組，其中G200和G400組的粗蛋白含量顯著高于G0組，G200組的粗脂肪含量顯著高于G0組。而飼料GSH水平對(duì)中華鱉肌肉水分和灰分含量無(wú)顯著影響。

表4 飼料GSH水平對(duì)中華鱉肌肉營(yíng)養(yǎng)成分的影響

2.3 飼料中添加GSH對(duì)中華鱉血清生化指標(biāo)的影響

由表5可知，飼料中添加谷胱甘肽對(duì)中華鱉TCHO、TG、GLU、TP和ALT活性均無(wú)顯著影響。而與G0組相比，G400組血清AST的活性則顯著上升。

表5 飼料GSH水平對(duì)中華鱉血清生化指標(biāo)的影響

2.4 飼料中添加GSH對(duì)中華鱉肝臟超氧化物歧化酶基因表達(dá)的影響

如圖1所示，GSH添加組的肝臟sod1基因相對(duì)表達(dá)量均高于G0組，其中G200組的相對(duì)表達(dá)量最高，顯著高于G0組；sod2基因相對(duì)表達(dá)量隨著GSH添加量的增加呈不斷升高的趨勢(shì)，在G400組出現(xiàn)最高值，相比G0組上升1.32倍。

圖1 GSH對(duì)中華鱉肝臟sod1和sod2基因表達(dá)量的影響

3 討論

3.1 GSH對(duì)中華鱉生長(zhǎng)性能的影響

本研究中添加適量的GSH能顯著提高中華鱉的WGR和FE，表明GSH可以改善中華鱉的生長(zhǎng)性能。該結(jié)果與GSH在牙鲆[8]、草魚(yú)[10]、羅非魚(yú)[11]、黃顙魚(yú)(Pelteobagrusfulvidraco)[12]、異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[13]、鱸(Dicentrarchuslabrax)[14]及凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvanname)[15]等水產(chǎn)動(dòng)物中的研究結(jié)果相似。另外，部分研究報(bào)道了飼料中添加GSH對(duì)花鱸(Lateolabraxjaponicus)[16]、皺紋盤(pán)鮑(Haliotisdiscushannai)[17]和斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)[18]的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響，分析可能與GSH在不同動(dòng)物的作用途徑有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，G200組和G400組肌肉粗蛋白、G200組肌肉粗脂肪含量顯著高于G0組。這說(shuō)明飼料中添加一定量的GSH可顯著影響中華鱉的粗蛋白和粗脂肪含量。這一結(jié)果與其在草魚(yú)[10]、羅非魚(yú)[11]和黃顙魚(yú)[12]上的結(jié)果相似，但在花鱸[16]和奧尼羅非魚(yú)[19]上沒(méi)有顯著性差異。這可能與GSH對(duì)不同魚(yú)種蛋白質(zhì)和脂肪代謝的作用方式不同有關(guān)。

3.2 GSH對(duì)中華鱉血清生化指標(biāo)的影響

血清膽固醇(TCHO)和甘油三酯(TG)是重要的脂類(lèi)物質(zhì),它們含量的高低在一定程度上反映了機(jī)體內(nèi)的脂類(lèi)吸收和肝臟脂肪代謝狀況[19]。在本實(shí)驗(yàn)中，添加GSH的各組血清TCHO和TG均高于G0組，這與在草魚(yú)[10]、羅非魚(yú)[11]和黃顙魚(yú)[12]上的研究結(jié)果一致。其原因可能是GSH 促進(jìn)了中華鱉體內(nèi)生長(zhǎng)激素GH的分泌，從而增強(qiáng)了其脂肪代謝，導(dǎo)致血清TCHO和TG含量的升高。血糖(GLU)來(lái)源于肝糖原分解和腸道吸收，是機(jī)體主要的供能物質(zhì)。血清總蛋白(TP)含量可反映機(jī)體蛋白質(zhì)代謝和營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，同時(shí)也與免疫相關(guān)聯(lián)。研究表明，血清TP的含量主要受飼料蛋白源質(zhì)量的影響，進(jìn)而顯著影響機(jī)體的蛋白質(zhì)代謝[20]。本實(shí)驗(yàn)中，添加GSH的各組GLU和TP含量與G0組無(wú)顯著差異，這與在草魚(yú)[10]、羅非魚(yú)[11]和黃顙魚(yú)[12]上的研究結(jié)果相同。其原因可能與各組飼料原料和營(yíng)養(yǎng)水平一致有關(guān)。

谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)主要存在于肝細(xì)胞內(nèi)，是機(jī)體內(nèi)轉(zhuǎn)氨基作用過(guò)程中非常重要的酶，臨床上常以血清中轉(zhuǎn)氨酶活性來(lái)衡量肝臟是否受損[21]。本實(shí)驗(yàn)中，添加GSH的各組血清AST活性均高于G0組，且在G400組達(dá)到顯著水平(P<0.05)。而飼料中添加GSH對(duì)ALT的活性無(wú)顯著影響，但G200和G400組的活性高于G0組。這些結(jié)果表明高劑量的GSH可能會(huì)影響對(duì)中華鱉肝臟的正常生理功能，但同時(shí)有助于轉(zhuǎn)氨基作用，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體合成非必需氨基酸的能力。

3.3 GSH對(duì)中華鱉肝臟超氧化物歧化酶基因表達(dá)的影響

超氧化物歧化酶(SOD)廣泛存在于動(dòng)植物中，根據(jù)分布的不同主要分為SOD1(Cu/Zn SOD，主要分布于胞漿)和SOD2(Mn/Fe SOD，主要分布于線(xiàn)粒體)。SOD是一種重要的抗氧化酶，能夠催化超氧化物發(fā)生歧化反應(yīng)，生成氧氣和過(guò)氧化氫，從而降低或清除細(xì)胞內(nèi)氧自由基含量。因此，其活性的高低可在一定程度上反映機(jī)體內(nèi)氧自由基的代謝情況及抗氧化能力[22-23]。在正常情況下，sod基因的啟動(dòng)子處于未開(kāi)放狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體受到刺激或逆境脅迫時(shí)，相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子可與sod基因啟動(dòng)子的順式作用元件結(jié)合，激活sod基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而表現(xiàn)在翻譯水平上，使SOD的活性上升[24]。周婷婷等[25]研究表明，飼料中添加一定量的GSH能提高吉富羅非魚(yú)sodmRNA的表達(dá)量。對(duì)凡納濱對(duì)蝦的研究也有相似結(jié)果，劉曉華等[26]表明飼料中添加適量的GSH可誘導(dǎo)其肝胰腺細(xì)胞sod基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而使肝胰腺細(xì)胞的SOD活性上升。本研究的結(jié)果顯示，GSH添加組的中華鱉肝臟sodmRNA表達(dá)量均高于G0組，其中G200組sod1 mRNA的表達(dá)量最高，而G400組sod2的表達(dá)量最高。這些結(jié)果表明，具有抗氧化功能的GSH可誘導(dǎo)中華鱉肝臟sod基因的表達(dá)，從而抑制活性氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[27]。

綜上所述，飼料中添加一定量的GSH能改善中華鱉的生長(zhǎng)性能，提高肌肉粗蛋白和粗脂肪含量以及部分血清生化指標(biāo)活性。此外，GSH還可誘導(dǎo)中華鱉肝臟sod1和sod2基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而提高機(jī)體的抗氧化能力。