王 雨，楊 建，耿龍武，張宇婷，姜海峰，徐 偉

(1.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱 150070；3.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，上海 201306)

魚類的精子活力主要是指精子壽命和精子運(yùn)動狀態(tài)等[1]，主要以精子激活比例和精子運(yùn)動時間等作為主要評價指標(biāo)[2]，精子活力的大小直接制約著精子的受精能力[3]。研究表明，水體中pH、無機(jī)離子、溫度、有機(jī)溶劑等因素對精子活力影響顯著[4]。我國東北地區(qū)鹽堿水域因其高堿度、高pH值等水質(zhì)特點[5]，對魚類的生長、繁殖影響較大，導(dǎo)致品種單一，漁業(yè)生產(chǎn)處于較低的水平。因此，開展pH對淡水魚類精子活力相關(guān)研究，對篩選適應(yīng)不同鹽堿水體環(huán)境的增養(yǎng)殖魚類品種具有重要意義。

擬赤梢魚(Pseudaspiusleptocephalus)、洛氏鱥(PhoxinuslagowskiiDybowskii)、松浦鏡鯉(CyprinuscarpioSongpu)和方正鯽(C.auratus)均屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)魚類，其中，洛氏鱥、松浦鏡鯉、方正鯽因其環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)[6-9]，是目前黑龍江水產(chǎn)研究所在鹽堿水域示范推廣的重點魚類品種。本研究通過顯微觀察法，研究了pH對擬赤梢魚、洛氏鱥、松浦鏡鯉和方正鯽精子活力的影響，旨在闡明4種魚類精子的酸堿耐受性，完善不同pH環(huán)境魚類的繁殖生物學(xué)特性，為東北鹽堿地區(qū)的漁業(yè)生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

實驗魚取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭試驗站，選擇成熟度好、健康無傷、體型正常擬赤梢魚、洛氏鱥、松浦鏡鯉和方正鯽各6尾，隨機(jī)選擇3尾魚精液用于精子活力和精液理化性質(zhì)檢測，4種魚類樣品質(zhì)量參數(shù)見表1。

表1 4種鯉科魚類樣品質(zhì)量參數(shù)

1.2 不同梯度試劑的配制

根據(jù)鄭學(xué)斌等[10]、李常鍵等[11]對鯉科魚類精子活力的研究，用0.1 mol/L的鹽酸溶液和0.1 mol/L氫氧化鈉溶液與去離子水分別配制5種pH為3.0、5.0、7.0、9.0、11.0的梯度溶液。實驗所用的氫氧化鈉、鹽酸均為國產(chǎn)分析純。

1.3 精液采集

將選取好的雄魚進(jìn)行人工藥物催產(chǎn)，待效應(yīng)時間后，用干燥潔凈的毛巾擦去魚體表面及生殖孔附近的水分，輕壓魚腹部使精液流出，滴入2 mL離心管中，4 ℃暫存待測。精液采集過程中摻入尿液、血液和糞便的樣本不予使用。

1.4 精液理化特性測定

1.4.1 精液濃度

精液由精子和精漿組成，精子細(xì)胞體積占精液總體積的百分比，即精液濃度[12]。計算公式：

精液濃度=(精液總體積-上清液體積)/精液總體積×100%

本實驗將采集的精液取1 mL，常溫1 000 r/min離心30 min，每種魚類測定3個樣本，并計算其平均值。

1.4.2 精子密度

本實驗取采集的精液2 μL，用0.85%的NaCl溶液，將精液稀釋1 000倍，用血球計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)，計算精子密度，每種魚類測定3個樣本，結(jié)果取平均值。

精子密度(個/mL)=(80小格內(nèi)精子數(shù)/80)×400×104×稀釋倍數(shù)[13]

1.4.3 精漿pH檢測

取新鮮采集精液2 mL，用pH儀(Sartorius)測定精液的pH。

1.5 精子活力觀察與測定

用解剖針蘸取微量精液于載玻片上，100 μL移液槍吸取不同pH精子激活液滴加3滴至精液，并迅速用槍頭將其攪勻，無需加蓋蓋玻片，同時用秒表計時，于10×10倍光學(xué)顯微鏡(BX1 Olympus microscope)下觀察，并記錄精子激活率、快速運(yùn)動時間、運(yùn)動時間及精子壽命。精子活力觀察標(biāo)準(zhǔn)參照蘇德學(xué)等[14]的等級標(biāo)準(zhǔn)：精子的激活率以激活起始時給定視野內(nèi)被激活精子數(shù)量占全部精子數(shù)量的百分?jǐn)?shù)計算；精子快速運(yùn)動時間(FT)以精子激活開始至70%的精子能看清運(yùn)動軌跡的時間計算；精子的運(yùn)動時間(MT)以精子激活開始至90%的精子原地顫動為止的時間計算；精子的壽命(LT)以精子自然激活開始至90%的精子停止運(yùn)動為止的時間計算。每個pH梯度每種魚類檢測3個樣本，取其平均值。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。采用Duncan法進(jìn)行多重比較以檢驗其差異顯著性(P<0.05)，使用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 精液基本理化特征

擬赤梢魚、洛氏鱥、松浦鏡鯉、方正鯽新鮮精液的精液濃度和精子密度如表2所示，精液濃度由高到低依次為松浦鏡鯉>方正鯽>洛氏鱥>擬赤梢魚，精子密度由高到低依次為松浦鏡鯉>洛氏鱥>方正鯽>擬赤梢魚；洛氏鱥精漿偏酸性，擬赤梢魚精漿呈中性，而松浦鏡鯉、方正鯽精漿呈弱堿性。

表2 4種鯉科魚類精液基本理化特征

2.2 pH對精子活力的影響

pH對精子活力的影響如圖1所示，4種鯉科魚類的精子在pH 3.0～11.0范圍內(nèi)，其活力均隨著pH的升高而呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢；其中，擬赤梢魚、洛氏鱥精子的激活率、FT、MT、LT均在pH 7.0時達(dá)到最高，精子激活率分別為(93.99±5.77)%和(96.67±2.89)%，F(xiàn)T分別為(35.32±0.81)s和(34.27±0.49)s，MT分別為(52.24±0.99)s和(44.33±0.76)s，LT分別為(71.50±5.50)s和(75.22±3.50)s；松浦鏡鯉精子激活率在pH 7.0時最高，為(96.67±2.89)%，其FT、MT和LT在pH為9.0時達(dá)到最大值，分別為(46.80±1.82)s、(64.94±4.52)s和(84.03±7.02)s；方正鯽精子活力的4個指標(biāo)均在pH 9.0時達(dá)到最高，分別為(93.33±2.89)%、(35.37±0.31)s、(85.18±2.04)s和(100.74±1.65)s。

圖1 不同pH條件下4種鯉科魚類精子活力變化

3 討論

3.1 精液的基本生物學(xué)特征

精子密度和精液濃度是評價魚類精子生物學(xué)特性的主要指標(biāo)。一般而言，同種魚類精子密度越高，精液濃度越大，而不同魚類之間魚類的精子密度和精液濃度因種類不同、精子形態(tài)、體積或繁殖季節(jié)不同而有各異[15]。

研究發(fā)現(xiàn)，不同魚類精子密度差異較大，如鱘科魚類精子密度相對較低，波斯鱘(Acipenserpersicus)[16]精子平均密度為1.54×109個/mL，中華鱘(A.sinensisGray)[17]精子平均密度為3.26×109個/mL；而鯉科魚類精子密度則較高，四大家魚精子平均密度為2.66×1010個/mL[18]。本研究中的4種鯉科魚類，其精子密度均與四大家魚的研究結(jié)果相近，其數(shù)量級均為1010個/mL。

本研究中，4種鯉科魚類的精子密度和精漿濃度在種間整體表現(xiàn)為精子密度越大，精液濃度越高的趨勢，松浦鏡鯉精液濃度與精子密度在4種鯉科魚類中最高，而擬赤梢魚精液濃度與精子密度則最低。Noveiri等[16]的研究同樣表明，精液濃度和精子密度之間存在著顯著正相關(guān)性，而魯大椿等[18]對部分淡水魚類精液生物學(xué)研究中亦有相似發(fā)現(xiàn)。此外，在本研究中方正鯽、洛氏鱥精液濃度與精子密度大小順序相反，推測出現(xiàn)這一現(xiàn)象是因為洛氏鱥精子個體較小，導(dǎo)致精子在精漿中的總體積減小。

在本研究中，擬赤梢魚精漿呈中性，松浦鏡鯉、方正鯽精漿呈弱堿性，而洛氏鱥精漿偏酸性，種間差異較大，但大多數(shù)魚類的精漿pH偏堿性[19]，只有少部分魚類精漿呈弱酸性，如大黃魚(Pseudosiaenacrocea)[20]精漿pH為6.7～7.2，目前有關(guān)魚類精漿偏酸性的原因尚不清楚，有學(xué)者推測這是與環(huán)境相適應(yīng)的結(jié)果[21]。

3.2 pH對精子活力的影響

外界pH環(huán)境是影響魚類精子活力的重要因素之一，當(dāng)精子處于適宜的pH環(huán)境條件下才可被有效激活。研究發(fā)現(xiàn)，無論是淡水魚類[22,23]，還是海水魚類[24,25]，其精子活力在中性或弱堿性的環(huán)境下精子激活率最高，且活性最強(qiáng)，而在酸性條件下魚類精子激活率降低、壽命短。

本研究證明，擬赤梢魚、洛氏鱥、松浦鏡鯉和方正鯽4種鯉科魚類精子活力在pH 7.0～9.0時效果較好，而在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿脅迫下表現(xiàn)差異較大。在pH 3.0(H+濃度為10-3mol/L)強(qiáng)酸性條件下，擬赤梢魚精子完全失活，洛氏鱥的精子激活率僅為21%，方正鯽和松浦鏡鯉精子僅能原地顫動；而在pH 11.0(OH-濃度為10-3mol/L)強(qiáng)堿條件下，擬赤梢魚部分精子仍具有活力，方正鯽精子激活率仍可達(dá)75%，松浦鏡鯉、洛氏鱥精子活力雖然受到抑制，但其激活率仍高于45%。對比強(qiáng)酸與強(qiáng)堿性環(huán)境對魚類精子活力的影響發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)酸條件對精子活力的抑制作用明顯高于強(qiáng)堿環(huán)境，這一現(xiàn)象，在黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[26]中也得到了證實。根據(jù)Morisawa等[27]的假說，這可能是由于胞外H+濃度的增加會破壞精子細(xì)胞結(jié)構(gòu)，進(jìn)而抑制精子活力和降低受精率所致。

綜上所述，擬赤梢魚精子對水體pH的變化環(huán)境最為敏感，而松浦鏡鯉、洛氏鱥次之，方正鯽精子對pH適應(yīng)性較強(qiáng)。在開展魚類人工繁育過程中，為提高其受精率，擬赤梢魚使用的水源pH應(yīng)控制在7.0中性相對穩(wěn)定的環(huán)境，而松浦鏡鯉、洛氏鱥、方正鯽pH控制在7.0～9.0弱堿性環(huán)境即可。