張成碩，周昊天，曾萌冬，王艷玲，趙金良，趙 巖

(上海海洋大學，水產(chǎn)種質資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306)

水體的酸堿度是影響魚類生活的重要環(huán)境因素[1]。淡水的緩沖能力較差，其酸堿度波動范圍較大。對于池塘養(yǎng)殖而言，水體pH的晝夜波動可達到6.6～10.2[2]。近年來，國內工業(yè)快速發(fā)展導致酸雨愈加頻繁，河流兩岸堿性粉煤灰、氧化鈣等違法亂排，以及養(yǎng)殖過程中殘留餌料過多、藥物的濫用及養(yǎng)殖密度過大等都加劇了水體pH變化[3-4]。酸堿環(huán)境變化(酸堿脅迫)對魚類生長性能、物質代謝、免疫防御等方面的影響十分明顯[5-9]。

化學防御系統(tǒng)是生物抵御環(huán)境中化學脅迫和維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要機制。解毒酶系(生物轉化酶系)是化學防御系統(tǒng)的核心組分。有毒害的疏水化合物在這些酶的作用下，轉化為更親水的衍生物從生物體中排除[10-11]。目前，在人類藥物代謝[12]，植物適應逆境環(huán)境脅迫(干旱、高溫、重金屬[13-14]等)，水生動物接觸化學藥劑(除草劑、殺蟲劑[15-17]等)過程中均有關于生物化學防御機制的研究報道。但魚類為適應水環(huán)境pH變化調動化學防御機制，進行的一系列生物轉化尚缺乏系統(tǒng)深入的研究。

鱖(Sinipercachuatsi)屬鱸形目鮨科鱖亞科鱖屬，俗稱桂花魚，是我國重要的名貴淡水經(jīng)濟魚類[18]。鱖魚養(yǎng)殖對水質要求較高[19-20]，對酸堿環(huán)境脅迫的適應機制有自身的特點。為了解酸堿脅迫對鱖的影響以及相應解毒作用，本研究對鱖進行不同pH的急性脅迫，測定72 h血清pH、耗氧率、CYP450、FMO、UGT和GST基因相對表達量的變化過程，從生理生化角度揭示酸堿對鱖的毒性及其適應機制，為其健康養(yǎng)殖與生產(chǎn)應用提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用鱖取自于上海市浦東新區(qū)孫農(nóng)水產(chǎn)養(yǎng)殖場。選取體質健康、規(guī)格基本一致，平均體重為(30±5)g的個體進行實驗。于上海海洋大學養(yǎng)殖中心控溫循環(huán)水族箱中暫養(yǎng)一周，每天投喂活餌料魚，及時清理殘餌和糞便，保證實驗魚的正常生理活動。實驗前24 h停止喂食。試驗用水為曝氣48 h以上的自來水，水溫(24.6±0.5)℃，pH為(7.5±0.1)，溶解氧大于5 mg/L。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集和處理

根據(jù)預實驗結果，用1 mol/L HCI和1 mol/L NaOH調節(jié)實驗液pH，設置酸堿度分別為4.0、5.5、7.0、8.5、10.0。實驗在透明水族箱(55 L)中進行。實驗時，將實驗魚從水族箱內取出，直接放入實驗組中，每組12尾，實驗期間不投喂餌料，實驗開始后，每隔5 h調整實驗液一次，充氧1 h，每隔24 h更換實驗液，脅迫后0、3、12、24、48、72 h進行采樣。每組隨機取2尾。

用1 mL一次性無菌注射器從魚尾靜脈處抽血，每尾魚抽血時間不超過5 min，血液注入經(jīng)抗凝劑處理的1.5 mL離心管中，4 ℃靜置過夜，分層后離心(1 500 r/min，4 ℃，25 min)，取出上層血清待用。抽血后的實驗魚，冰上解剖，快速取出腦、鰓、肝、腎組織，液氮速凍后，放入-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2.2 血清pH測定

采用FE20-FiveEasy PlusTM pH測定血清pH。為保證血清能浸沒探頭，將分離獲得的血清轉移到自制柱狀容器(內徑1.5 cm)中測量。同一樣本測量3次，取其平均值。

1.2.3 耗氧率測定

實驗使用的溶氧儀為德國WTW multi3620便攜式水質分析儀。實驗組水族箱用保鮮膜封口，透明膠帶固定，確保與空氣隔絕，中間留1圓孔，大小與溶氧儀的傳感器尺寸一致。實驗開始后，每隔1 h測定水體中的溶氧量。用下式計算耗氧率：

1.2.4 細胞自噬小體的定量檢測 不同濃度槐耳清膏（4、8、16、32mg/ml）作用 NCI-N87 細胞 24h 后，收集細胞，用濃度為1μg/ml吖啶橙室溫條件下避光染色20min，離心之后棄染液，用1×PBS清洗3次后，PBS重懸細胞，上流式細胞儀檢測，F(xiàn)L3通道檢測紅色熒光，F(xiàn)L1通道檢測綠色熒光，紅色熒光增強說明細胞內酸性自噬小體增多。

式中：R0為單位體重耗氧率[mg/(g/h)]，C0、C1為試驗前后水體的溶氧量(mg/L)；V為水體體積(L)；T為試驗持續(xù)時間(h)；W為魚體總體質量(g)。

1.2.4 熒光定量PCR

腦、鰓、肝、腎研磨成粉末后，按照TRIzol?Reagent(Invitrogen)說明書提供的方法提取總RNA，使用核酸蛋白測定儀和瓊脂糖凝膠電泳測定RNA的完整性，加入適量的RNase free ddH2O調整至1 000 ng/μL。用Prime ScriptRRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒合成cDNA第一鏈，反轉錄產(chǎn)物于-20 ℃冰箱保存待用。

根據(jù)GenBank中鱖GST(GenBank登錄號：EU719618.1)和UGT、CYP450、FMOcDNA序列(本實驗室所測鱖轉錄組數(shù)據(jù))，用Primer Premier 5.0軟件設計(表1)，引物由金唯智(蘇州)生物科技有限公司合成。

表1 定量PCR分析的引物序列

實時熒光定量PCR擴增體系如下(20 μL)：10 μL TB GreenTM Premix EX TaqTM(TaKaRa)，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，cDNA 1 μL，RNase-free water定容至20 μL。每個樣本做3個重復，以β-actin為內參建立標準曲線以及溶解曲線。在MyiQ5熒光定量PCR儀上進行擴增反應，反應條件為預變性95 ℃ 30 s；變性95 ℃ 5 s，延伸 60 ℃ 30 s，循環(huán)40次。數(shù)據(jù)分析采用CFX Manager軟件進行，基線值、閾值和閾循環(huán)值由軟件自動設定，采取相對定量2-ΔΔCt法計算表達量。

1.3 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析，單因素方差分析進行顯著性檢驗，Duncan多重比較檢測各測量指標的差異，以P<0.05為差異顯著。利用Sigmaplot 10.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 酸堿脅迫對鱖的行為影響

實驗鱖放入pH=7的組中無明顯應激現(xiàn)象，游動平緩正常，水質無變化。其他處理組中鱖在放入后表現(xiàn)為快速游動，尾部擺動幅度較大，鰓蓋擴張速率較快，隨后游動逐漸減緩，魚體懸浮靜止。其中，在pH=4與pH=10兩組的脅迫過程中，鱖體色明顯變淺，體表分泌物增多，形成一層灰白色薄膜，水質較為渾濁。在脅迫過程的后期，鱖時而出現(xiàn)亂沖撞現(xiàn)象，魚體發(fā)生微斜，不能保持平衡，眼部稍有凸起。實驗過程中沒有出現(xiàn)死魚現(xiàn)象。

2.2 酸堿脅迫對鱖血清pH的影響

pH=7組鱖血清pH較穩(wěn)定，維持在7.31～7.43，其他各酸堿度處理組中，脅迫3 h后鱖血清pH均發(fā)生顯著變化。pH=4組的鱖血清pH始終呈持續(xù)下降趨勢，于72 h達到6.20。pH=5.5組的鱖血清pH呈先下降后上升再下降的變化趨勢。pH=8.5組和pH=10組的鱖血清pH呈先上升后下降再上升趨勢(表2)。

表2 酸堿脅迫對鱖血清pH的影響

2.3 酸堿脅迫對鱖耗氧率的影響

不同酸堿度脅迫對鱖耗氧率的影響結果如圖1所示。組內方差分析結果顯示，各實驗組間存在極顯著性差異。隨著脅迫時間的增加，除pH=7組耗氧率變化趨勢較為穩(wěn)定外，其余各實驗組耗氧率在12 h后均呈現(xiàn)出先升高再降低的變化趨勢，其中，pH=8.5組耗氧率峰值出現(xiàn)在36 h；pH=4、pH=5.5與pH=10組耗氧率峰值均出現(xiàn)在42 h。另外pH=4組其耗氧率在12 h后較同一時段不同pH脅迫組均處于最低的狀態(tài)。單因素方差分析得出，pH對鱖耗氧率的影響極顯著。

圖1 不同酸堿度脅迫對鱖耗氧率的影響

2.4 酸堿脅迫對鱖不同組織解毒反應相關基因表達的影響

2.4.1 酸堿脅迫對鱖肝臟組織中解毒基因表達的影響

如圖2所示，pH=7組鱖肝臟各相關解毒基因的相對表達量無顯著變化，而其余各實驗組相關解毒基因的相對表達量在酸堿脅迫過程中呈明顯先升高后降低的變化趨勢。其中，在酸堿脅迫3 h后，UGT基因與GST基因開始顯著升高，脅迫12 h后，CYP450基因與FMO基因開始顯著升高，此時GST基因相對表達量達最高值，隨后呈下降趨勢。在脅迫48 h后，CYP450、FMO與UGT基因相對表達量均達到最高值，至脅迫72 h相對表達量下降，但顯著高于pH=7組。

圖2 酸堿脅迫對鱖肝臟組織中解毒基因表達的影響

2.4.2 酸堿脅迫對鱖腎臟組織中解毒基因表達的影響

如圖3所示，在72 h的酸堿脅迫過程中，pH=7組鱖腎臟各相關解毒基因的相對表達量無顯著變化，而其余各實驗組相關解毒基因的相對表達量在脅迫過程中呈明顯先升高后降低的變化趨勢。其中，pH=8.5組與pH=10組各基因相對表達量均在脅迫48 h后達最高值，至脅迫72 h相對表達量下降。脅迫3 h后CYP450基因與UGT基因開始顯著升高，脅迫12 h后，F(xiàn)MO基因與GST基因開始顯著升高。至脅迫24 h后，pH=5.5組的CYP450基因與FMO基因達到最高值，隨后呈下降趨勢。

圖3 酸堿脅迫對鱖腎臟組織中解毒基因表達的影響

2.4.3 酸堿脅迫對鱖腦中解毒基因表達的影響

如圖4所示，在72 h的酸堿脅迫過程中，pH=7組鱖腦部各相關解毒基因的相對表達量無顯著變化，而其余各實驗組相關解毒基因的相對表達量在脅迫過程中呈明顯先升高后降低的變化趨勢。脅迫3 h后，除pH=7組外，各實驗組相關解毒基因的相對表達量均開始顯著升高，至脅迫24 h后，除pH=7外，各實驗組UGT基因均達最高值，隨后呈下降趨勢。脅迫48 h后，CYP450、FMO與GST基因相對表達量均達到最高值，至脅迫72 h后表達量下降。

圖4 酸堿脅迫對鱖腦中解毒基因表達的影響

2.4.4 酸堿脅迫對鱖鰓中解毒基因表達的影響

在72 h的酸堿脅迫過程中，pH=7組鱖鰓部各相關解毒基因的相對表達量無顯著變化，而其余各實驗組相關解毒基因的相對表達量在脅迫過程中呈明顯先升高后降低的變化趨勢(圖5)。脅迫12 h后，除pH=7組外，各實驗組相關解毒基因的相對表達量均開始顯著升高，至脅迫24 h后，除pH=7外，各實驗組UGT基因與GST基因均達最高值，隨后呈下降趨勢。脅迫48 h后，各實驗組CYP450基因與FMO基因相對表達量均達到最高值，至脅迫72 h后表達量下降。

圖5 酸堿脅迫對鱖鰓中解毒基因表達的影響

3 討論

3.1 酸堿脅迫對鱖血清pH的影響

3.2 酸堿脅迫對鱖耗氧率的影響

魚類的大多數(shù)代謝活動都離不開氧的參與，耗氧率能夠反應魚類的生理狀況。朱愛意等[24]研究發(fā)現(xiàn)，魚體可以通過改變代謝狀況，消耗較多的能量以適應外界環(huán)境pH變化，但超出一定范圍，耗氧率會降低。例如長鰭籃子魚(Siganuscanaliculatus)幼魚在pH=6.0時耗氧率最低，pH=9.0時耗氧率最高[25]。pH值為8.2～9.2時，米諾魚的耗氧率顯著高于其他pH時的水平[26]。本研究中，pH=5.5、8.5、10組中耗氧率在脅迫24 h后均出現(xiàn)上升趨勢，且在36～60 h間耗氧率均超過pH=7組，而pH=4組中鱖耗氧率均處于最低狀態(tài)，說明水體環(huán)境pH=5.5～10，鱖通過提高耗氧率、消耗更多的能量來適應酸堿脅迫，而pH4的酸性環(huán)境對鱖的耗氧率有強烈的抑制作用。

3.3 酸堿脅迫下鱖不同組織中解毒反應相關基因的表達

對于水體中存在的氨氮、亞硝酸鹽、硫化氫等有毒物質，pH的劇烈波動均能夠使這些有毒物質毒性加強，從而致使魚類中毒[27-28]。環(huán)境脅迫下的生物將會啟動生物體化學防御，通過生物轉化過程將各種有機或無機的毒物(包括各種藥物、環(huán)境毒素和酚類物質等)主動排出體外[29]。具體而言，Ⅰ相酶將有害毒物轉化為親水性的酚或親電性的苯醌和環(huán)氧化物，Ⅱ相酶與之結合，在運輸酶的作用下排出體外[10]。研究報道，細胞色素P450等代謝基因能夠清除貽貝毒素對大西洋鮭(Salmosalar)的毒害作用[30]；GST基因參與去除淡水魚類微囊藻毒素的過程[31]；斑馬魚(Daniorerio)UGT超家族在葡糖醛酸化過程中，使葡糖醛酸與內源或外源底物的羧基、硫基等基團結合形成毒性更低的葡糖苷酸[32]；劉雨等[33]在鱖幼魚的急性氨氮脅迫實驗中發(fā)現(xiàn)，脅迫初期谷胱甘肽(GSH)基因表達量會出現(xiàn)上調趨勢。本研究中，pH=7組中鱖解毒相關基因(CYP450、FMO、UGT、GST)在不同組織中(肝、腎、腦、鰓)的表達量始終無顯著變化，其余酸堿脅迫實驗組中在脅迫3 h后，不同組織中基因的表達量均出現(xiàn)上調趨勢，說明在外源性酸堿的作用下，鱖魚體內會啟動生物體化學防御來維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)，且Ⅰ相反應與Ⅱ相反應均具有重要作用；酸堿脅迫24～48 h，基因表達量達到峰值，隨后呈下降趨勢，這與耗氧率在此時間段內變化趨勢相同，說明鱖在去除酸堿脅迫產(chǎn)生的毒性的過程中需要消耗能量；脅迫72 h后，酸堿實驗組的基因表達量均出現(xiàn)下調，這可能是因為鱖在此脅迫環(huán)境下的逐漸適應；另外，酸度與堿度實驗組的基因表達量總體差異不大，這或許與解毒過程中的作用底物類似有關。