吳峪楠，楊移斌，周 順，劉永濤，董 靖，劉紹春，艾曉輝

(1.上海海洋大學水產(chǎn)科學國家級試驗教學示范中心，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點試驗室，湖北省水產(chǎn)品質(zhì)量安全工程技術研究中心，武漢430223；3.岳陽漁美康生物科技有限公司，湖南岳陽 414199)

克氏原螯蝦(Procambarusclarkia)，也稱小龍蝦、紅螯蝦、克氏螯蝦，在分類上屬節(jié)肢動物門(Arthropoda)，甲殼綱(Crustacea)十足目(Decopoda)螯蝦科(Cabaridae)。克氏原螯蝦是我國種群數(shù)量最大的淡水蝦類之一，其肝胰腺可以分泌與合成消化酶、脂肪酶和酯酶，對營養(yǎng)物質(zhì)進行吸收[1,2]，同時也影響無機物的貯藏、糖類代謝、排泄、蛻皮周期等過程，通常可觀察蝦的肝胰腺作為判斷健康狀況的標志[3]。目前水產(chǎn)動物的肝損傷模型研究多為魚類肝損傷模型[4-6]。甲殼動物的模型研究已有病毒、細菌的預測模型見諸報道[7-9]，關于甲殼動物肝胰腺損傷模型的報道則較少。

高效氯氰菊酯，化學名稱2，2-二甲基-3-(2，2-二氯乙烯基)環(huán)丙烷羧酸-α-氰基-(3-苯氧基)-芐酯，是一種常見的殺蟲劑，常用于清塘和防治寄生蟲疾病。菊酯類農(nóng)藥對魚類、蝦蟹類等水生動物的毒性很高，會造成許多組織器官的病變[10]。高效氯氰菊酯對作為一種疏水性化合物，能聚集在細胞膜周圍，改變膜的流動性，破壞膜的結構，導致氧自由基增多[16,17]，進而使鰓和肝胰腺等組織器官受到氧化損傷[11]。

本研究以克氏原螯蝦為試驗對象，用高效氯氰菊酯誘導克氏原螯蝦肝胰腺的損傷，探索克氏原螯蝦肝胰腺損傷模型的合適時間與濃度，篩選肝胰腺損傷程度評價指標，為研究克氏原螯蝦肝胰腺損傷的發(fā)生、發(fā)展，肝胰腺損傷的病理特征，以及評價肝胰腺損傷相關防治藥物等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

高效氯氰菊酯：購于武漢中博水產(chǎn)生物技術有限公司，藥品有效成分含量為4.5%，以此配置成母液，根據(jù)試驗需要稀釋成不同濃度試劑，現(xiàn)配現(xiàn)用。

生化指標試劑盒：SYSMEX CHEMIX-180全自動生化分析儀配套試劑盒。

抗氧化酶和氧化產(chǎn)物檢測試劑盒：南京建成生物工程公司生產(chǎn)的SOD(超氧化物歧化酶)酶試劑盒、CAT(過氧化氫酶)酶試劑盒和氧化產(chǎn)物MDA(丙二醛)試劑盒。

蘇木精、伊紅染液：購買自武漢皮諾飛生物科技有限公司。

1.2 試驗動物與養(yǎng)殖條件

克氏原螯蝦購自湖北省荊州市沙市農(nóng)場洪塘分場，選擇附肢完整、活力強、規(guī)格相近的克氏原螯蝦用于試驗，試驗用蝦體重(23±0.67)g。試驗開始前將克氏原螯蝦放入規(guī)格為(40 cm×30 cm×60 cm)的水族箱中暫養(yǎng)7 d，養(yǎng)殖水深10 cm，試驗用水為經(jīng)充分曝氣3 d的自來水，水溫(25±1)℃，連續(xù)充氣增氧以保證水中溶氧充足。每天投喂小龍蝦飼料2次(9:00和16:00)，投喂量為蝦體重的1%～3%，每天清除殘餌與糞便并換水1/3，以保證水質(zhì)清潔。

1.3 試驗設計

建模濃度確定：根據(jù)文獻[10]可知，4.5%高效氯氰菊酯農(nóng)藥對克氏原螯蝦的96 h LC50為0.2 μg/L，在此基礎上進行預實驗，根據(jù)結果96 h LC50的1/40、1/20、1/10三個濃度對克氏原螯蝦是安全的，高于此濃度會導致克氏原螯蝦死亡。因此選擇0.00、0.005、0.01、0.02 μg/L四個濃度進行試驗。試驗在水族箱中進行，養(yǎng)殖水體積30 L，水溫(25±1)℃。準確加入相應體積的4.5%高效氯氰菊酯農(nóng)藥，每組30尾蝦。觀察并記錄克氏原螯蝦的中毒癥狀和死亡數(shù)(用玻璃棒觸碰蝦腹部5 min內(nèi)無反應即視為死亡[18])，死蝦及時撈出。試驗開始后0.5、1、2 d采集蝦樣，每個濃度組6尾蝦。試驗期間每天換水1/2并加入相應體積4.5%高效氯氰菊酯農(nóng)藥，以保證水體藥物濃度不變。試驗前1 d停止投喂飼料，試驗期間不投喂飼料。

建模天數(shù)確定：克氏原螯蝦隨機放入水族箱，30尾/箱。試驗分成4組，設置2個試驗組和2個空白對照組，每組10尾蝦。試驗前克氏原螯蝦隔夜禁食。通過濃度確定試驗結果，選擇最適給藥濃度進行試驗，試驗條件同模型濃度確定試驗，觀察克氏原螯蝦的表現(xiàn)癥狀，于染毒后0.5、1、2、3、5、7、14 d分別從空白組和試驗組采集6尾蝦取樣。

肝胰腺損傷程度評價指標篩選與病理切片觀察：根據(jù)濃度確定試驗設置給藥濃度，給藥方法同建模天數(shù)確定試驗。在試驗第0.5、1、2、3、5、7、14天時從水族箱隨機采集6尾蝦，采集血清測定生化指標TP(血清總蛋白)、ALP(堿性磷酸酶)和GLU(血糖)，采集肝胰腺測定超氧化物歧化酶SOD、CAT和氧化產(chǎn)物MDA和病理切片觀察。

1.4 樣品采集與測定

1.4.1 樣品采集

在各時間點取出克氏原螯蝦，稱重后用酒精擦拭頭胸甲部分，用無菌注射器從克氏原螯蝦圍心腔采集血淋巴，放入無菌離心管中，在4 ℃，10 000 r/min條件下離心10 min，取上層血清于-20 ℃保存，用于測量生化指標?？焖俳馄嗜〕鑫r的肝胰腺，用預冷生理鹽水清洗，濾紙吸干；取一小部分放入福爾馬林中固定，用于制作病理切片；剩余部分置于-20 ℃冰箱保存，用于測定抗氧化酶和氧化產(chǎn)物。

1.4.2 樣品測定

血清生化指標測定：凍存血清置于4 ℃冰箱解凍，生化指標(AST、ALT、TP、ALP和GLU)測定使用SYSMEX CHEMIX-180全自動生化分析儀檢測。

肝胰腺抗氧化酶和氧化產(chǎn)物測定：克氏原螯蝦肝胰腺樣品解凍后稱重，按照1 ∶9(W/V)比例加入預冷生理鹽水，用玻璃勻漿器制備10%的組織勻漿，在4 ℃、3 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，4 ℃保存并于1天內(nèi)進行測定?？寡趸钢笜薙OD、CAT和氧化產(chǎn)物MDA的測定方法按照試劑盒說明書操作。

組織病理切片觀察：肝胰腺經(jīng)酒精梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后組織切片，切片厚度4～5 μm，HE染色，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，各組數(shù)據(jù)均表示為平均數(shù)±標準差。多組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計方法采用單因素方差分析(one-way ANOVA)法，當差異顯著時，采用Duncan′s法進行多重比較；兩兩數(shù)據(jù)的比較方法采用獨立樣本t檢驗方法。P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同濃度高效氯氰菊酯對克氏原螯蝦血清轉(zhuǎn)氨酶的影響

由圖1可知，經(jīng)過不同濃度高效氯氰菊酯給藥后，與空白對照組相比，克氏原螯蝦血清AST活性在0.5、1 d時所有實驗組皆沒有顯著變化；給藥2 d后，僅0.02 μg/L實驗組與空白對照組相比，AST活性有顯著升高。

不同濃度高效氯氰菊酯對克氏原螯蝦ALT活性的影響見圖1，0.02 μg/L高效氯氰菊酯實驗組在0.5 d時與對照組相比無顯著變化，在1 d和2 d時與對照組相比，ALT活性均顯著升高。其他濃度給藥組各時間點與對照組無顯著差異。

圖1 不同濃度高效氯氰菊酯對克氏原螯蝦血清轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

根據(jù)試驗結果，確定0.02 μg/L高效氯氰菊酯為建立克氏原螯蝦肝胰腺損傷模型的適宜染毒模型濃度。

2.2 不同時間高效氯氰菊酯對克氏原螯蝦血清轉(zhuǎn)氨酶的影響

根據(jù)2.1的結果，采用0.02 μg/L高效氯氰菊酯對克氏原螯蝦進行給藥，各時間點克氏原螯蝦的血清AST和ALT活性見圖2。

圖2 不同時間克氏原螯蝦血清轉(zhuǎn)氨酶變化

與空白對照組相比，染毒2 d后實驗組AST活性開始顯著上升，至第3 d達到峰值，差異極顯著。第7 d時有所下降，但仍顯著高于空白對照組14 d時AST活性和空白對照組之間已沒有顯著差異。實驗組 AST活性第2天至第5天顯著高于0.5天實驗組的AST活性，總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。各時間點對照組 AST值無顯著變化。

與空白對照組相比，1 d后實驗組的血清ALT活性顯著升高，3 d時ALT活性達到峰值，在5 d時開始下降并持續(xù)到第7 d，但仍顯著高于空白對照組。第14天時實驗組ALT活性恢復至正常水平。實驗組 ALT活性在第1天至第3 d顯著高于0.5 d實驗組的ALT活性，第5 d時ALT活性接近0.5 d時ALT活性，總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。各時間點對照組 ALT值無顯著變化。

根據(jù)試驗結果，在第3 d時，血清轉(zhuǎn)氨酶活性與空白對照組相比有顯著變化；第3 d時血清轉(zhuǎn)氨酶活性與實驗組0.5 d時相比有顯著變化。因此確定3 d作為克氏原螯蝦肝胰腺損傷模型的適宜染毒模型天數(shù)。

2.3 克氏原螯蝦肝胰腺損傷程度評價指標篩選

2.3.1 克氏原螯蝦血淋巴生化指標篩選

由表1可以看出，在試驗開始后至第2 d，實驗組TP含量相比空白對照組略微下降，無顯著差異(P>0.05)；隨著時間延長，TP含量呈現(xiàn)下降趨勢。第3 d時TP含量對比空白對照組顯著下降(P<0.05)，第5 d開始TP含量極顯著降低且持續(xù)至第14 d(P<0.01)。與實驗組0.5 d相比，第5 d至第14 d實驗組TP含量出現(xiàn)顯著降低(P<0.05)，說明此時肝胰腺出現(xiàn)較嚴重損傷。

根據(jù)表1，對比對照組ALP活性在2 d時升高，第3 d降低，第5 d升高，變化均沒有顯著差異(P>0.05)，且變化無明顯規(guī)律。GLU的變化如表1所示，在第2 d實驗組數(shù)值下降，第3 d又上升，和空白對照組相比全程無顯著變化，沒有明顯變化規(guī)律。

表1 高效氯氰菊酯給藥后各時間點血清生化指標水平

2.3.2 克氏原螯蝦肝胰腺抗氧化指標篩選

高效氯氰菊酯對克氏原螯蝦肝胰腺CAT活性影響隨時間變化情況如圖3所示，各時間點空白對照組 CAT值無明顯變化(P>0.05)。與空白對照組相比，給藥1 d后，實驗組CAT活性顯著上升(P<0.05)，到第3 d時CAT活性達到最大值且顯著高于空白對照組(P<0.05)，第7 d時CAT活力下降至與空白對照組相似(P>0.05)，14 d時CAT活力顯著低于空白對照組(P<0.05)。CAT活性總體呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。

由圖3可知，與空白對照組相比，實驗組SOD活性在第2 d開始顯著升高(P<0.05)，第3 d時達到最高峰，差異極顯著(P<0.01)。第5 d活性下降，與空白對照組相比仍顯著升高(P<0.01)。第7 d SOD活性接近對照組，無顯著差異(P>0.05)，第14 d時SOD活性恢復至正常水平(P>0.05)。與實驗組0.5 d相比，第2 d至5 d實驗組SOD活性顯著升高(P<0.05)，SOD活性總體呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。

圖3 不同時間克氏原螯蝦肝胰腺CAT、SOD和MDA水平

根據(jù)結果，對比空白對照組，肝胰腺MDA的含量在試驗第2 d顯著增加(P<0.05)，隨著時間增加，MDA含量極顯著增多(P<0.01)，并一直持續(xù)至14 d。與實驗組0.5 d相比，第2 d至第14 d實驗組MDA的含量顯著降低(P<0.05)。

2.4 高效氯氰菊酯脅迫下克氏原螯蝦肝胰腺組織結構觀察

對0.20 μg/L實驗組的不同時間的組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，試驗開始0.5 d后，空白對照組克氏原螯蝦肝胰腺小管呈星形，結構完整，細胞飽滿，分布均勻，肝管上可見少量棕色顆粒(圖4-1)。而0.5 d后克氏原螯蝦肝管上皮細胞內(nèi)可見大量液泡，與0.5 d空白對照組比較，未見淤血或炎癥反應，肝管上棕色顆粒數(shù)量增多(圖4-2)。處理1 d后切片顯示，克氏原螯蝦肝管排列緊密，肝管上皮細胞內(nèi)可見大量液泡，肝管上可見少量棕色顆粒，與對照組比較，管腔未見明顯變窄(圖4-3)。2 d時肝管上皮細胞內(nèi)可見大量液泡，管腔未見明顯變窄，肝管上可見少量棕色顆粒，局部肝管排列疏松，間隙增寬，間質(zhì)可見少量炎性細胞滲出，炎癥反應出現(xiàn)(圖4-4)。實驗組給藥3 d時，肝管排列較緊密，肝管上可見少量棕色顆粒，肝管上皮細胞內(nèi)可見大量液泡，少量液泡明顯增大，間質(zhì)偶見炎性細胞滲出(圖4-5)。第5 d時，實驗組肝管上可見大量液泡，肝管上可見少量大液泡，并可見破裂后相互融合，肝管上可見少量棕色顆粒，肝管排列疏松，間隙大(圖4-6)，肝細胞出現(xiàn)較明顯損傷且損傷不可逆轉(zhuǎn)。第7 d時，肝細胞壞死溶解(黑色箭頭)，可見棕色顆粒增多，肝管上皮細胞內(nèi)可見大量液泡管腔變大(圖4-7)。實驗組14 d時，棕色顆粒數(shù)量減少，肝細胞腫大，細胞數(shù)量明顯減少，肝胰腺小管基膜破裂，肝胰腺小管結構受損嚴重(圖4-8)。

圖4 克氏原螯蝦肝胰腺組織病理

3 討論

3.1 高效氯氰菊酯對克氏原螯蝦血清生化指標的影響

ALT主要存在于細胞質(zhì)內(nèi)，而 AST主要存在于線粒體和細胞質(zhì)中。正常情況下二者只有極少量釋放入血液，當肝組織受到急性損傷時，這兩種酶會隨組織損傷逸出臟器，使血清中轉(zhuǎn)氨酶的活性顯著升高[19]。如果血清ALT升高并同時伴有AST明顯升高則提示肝細胞嚴重受損，因此轉(zhuǎn)氨酶是評價肝臟損傷程度的重要指標。盧敬讓等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，在不同鎘濃度脅迫中華絨螯蟹條件下，血清ALT活力隨著鎘濃度增加而升高；同一鎘濃度組中，ALT活力在72 h內(nèi)隨時間增加而提高，該實驗結果與本試驗結果一致。在本試驗中，0.02 μg/L實驗組給藥1 d時ALT活性開始顯著升高并持續(xù)至第3 d，第5 d ALT活性降低，說明第1 d至第3 d克氏原螯蝦的肝細胞膜受到損害，細胞膜通透性增加導致血清中ALT活性升高；第5 d開始肝細胞損傷已進入較嚴重階段，肝細胞中ALT流失較多，因此血清ALT的活性下降。本試驗AST活性在第3 d時顯著升高，第5 d時有極顯著升高，由于AST主要分布于肝細胞的線粒體和細胞質(zhì)中，因此AST的升高晚于ALT。根據(jù)結果推測第1 d至第3 d處于肝損傷的進展階段，第5 d時克氏原螯蝦肝胰腺損傷較嚴重，可能已經(jīng)造成線粒體損傷。

血清總蛋白TP為血清中所含各種蛋白質(zhì)的總稱，TP主要由肝臟合成，當血液中TP降低，則反映肝臟合成功能和肝實質(zhì)細胞儲備功能的下降[21]。試驗結果顯示第3 d時TP含量出現(xiàn)顯著降低，說明第3天開始肝胰腺細胞受到損傷；第5 d呈現(xiàn)極顯著降低且持續(xù)至14 d，表示第5 d開始肝胰腺出現(xiàn)不可逆損傷導致TP含量持續(xù)降低。ALP和GLU的檢測結果未表現(xiàn)出明顯規(guī)律可能與檢測方法不適用于克氏原螯蝦有關。

3.2 高效氯氰菊酯對克氏原螯蝦肝胰腺的抗氧化結果的影響

SOD和CAT是機體抗氧化系統(tǒng)的關鍵酶，MDA是脂質(zhì)過氧化的代謝產(chǎn)物，這 3 個指標的變化能反映機體受氧化損傷程度。楊宗英等[22]研究發(fā)現(xiàn)1.6、8.0和16.0 μg/L阿維菌素脅迫克氏原螯蝦96 h，克氏原螯蝦肝胰腺SOD的活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，CAT和MDA的值隨著時間增加而增大。陶易凡等[23]研究發(fā)現(xiàn)，高pH(pH=10.2)脅迫克氏原螯蝦96 h后，克氏原螯蝦的肝胰腺CAT活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，SOD活性呈逐漸下降的變化趨勢，MDA的含量隨著時間增加而增大。本試驗中，肝胰腺CAT的活性在從第1 d開始與空白對照組相比顯著升高，SOD的活性在第2 d開始顯著升高，在第3 d時活性均達到最大，同時肝胰腺中的 MDA含量持續(xù)升高，說明此時是高效氯氰菊酯對克氏原螯蝦的氧化脅迫進展階段，細胞產(chǎn)生損傷同時尚能產(chǎn)生抗氧化酶與自由基對抗；第5 d之后CAT和SOD的活性開始下降，但仍然高于對照組，MDA的含量與0.5 d相比顯著升高，此時機體的活性氧產(chǎn)生速度超過了對活性氧的清除能力，說明肝胰腺受到的氧化損傷較嚴重，機體的抗氧化平衡受到破壞。14 d時實驗組CAT活性顯著低于對照組，SOD的活性略低于對照組，此時MDA大量積累，肝胰腺損傷嚴重。本試驗與其他研究結果不同的原因可能是由于不同的藥物對克氏原螯蝦的毒性不一樣有關。

3.3 高效氯氰菊酯對克氏原螯蝦肝胰腺組織結構的影響

克氏原螯蝦的肝胰腺位于頭胸部中央，心臟前方，肝胰腺小管是其結構和功能的基本單位，肝胰腺是甲殼動物進行解毒、排泄和代謝的重要器官。本試驗中，隨著給藥時間增加，肝胰腺細胞中空泡數(shù)量增加，體積增大，這與中華絨螯蟹受到溴氰菊酯脅迫表現(xiàn)出的癥狀相似，因此肝胰腺上皮細胞空泡中可能含有氯氰菊酯或其代謝物，空泡的作用是將有毒物質(zhì)排出體外。據(jù)王權[24]推測，克氏原螯蝦肝胰腺中的棕色顆粒的產(chǎn)生可能與克氏原螯蝦的解毒功能有關。本試驗中，0.5 d時出現(xiàn)棕色顆粒并持續(xù)至第7 d，第14 d時棕色顆粒數(shù)量明顯減少，可能是由于肝胰腺受損嚴重導致解毒功能降低有關。在試驗第2 d時肝胰腺有炎癥反應出現(xiàn)，此時間質(zhì)可見少量炎性細胞滲出，第3 d炎癥加劇。第5 d時出現(xiàn)細胞破裂現(xiàn)象，此時肝細胞損傷嚴重，已出現(xiàn)不可逆修復，之后隨著時間延長肝胰腺結構受損加劇，此時間段開展藥物治療試驗不會有顯著效果出現(xiàn)，結合血清生化指標和抗氧化相關指標的結果認為選擇第3 d建立肝胰腺損傷模型較為適宜。