張 浩 胡佩佩 邵建國 季佩東 蔣 潔

(南京中醫(yī)藥大學(xué)南通附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇 南通 226000)

原發(fā)性肝癌為我國高發(fā)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率位居癌癥第4位，死亡率為第3位[1]。我國原發(fā)性肝癌的發(fā)生主要與慢性乙型肝炎、脂肪肝、黃曲霉素感染及自身免疫性肝炎相關(guān)。如何提高肝癌的早期診斷，提供有效治療，從而提高患者生活質(zhì)量，延長生存期，成為目前亟需解決的問題。近年，中醫(yī)中藥在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)上，充分發(fā)揮優(yōu)勢，在肝癌治療領(lǐng)域取得了巨大成就，已經(jīng)被廣泛用于原發(fā)性肝癌及肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的治療。本研究以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，應(yīng)用傳統(tǒng)方藥，并結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)，研究下瘀血湯在肝細(xì)胞性肝癌治療中的作用及機(jī)制。

核仁紡錘體相關(guān)蛋白1(Nusap1)是一種新型的55-kd脊椎動物蛋白，是一種重要的微管和染色質(zhì)結(jié)合蛋白，將染色體連接到有絲分裂紡錘體[2]，具有捆綁并穩(wěn)定微管、防止解聚、保持紡錘體完整性的作用[3]。越來越多的研究證實，Nusap1與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，而下調(diào)Nusap1的表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞的增殖明顯受到抑制[4]，這些作用可能是通過調(diào)控微小RNA-122(miR-122)調(diào)控肝癌的進(jìn)展實現(xiàn)的[5]，因此有望成為肝癌治療的新靶點。此外，有研究顯示，抑制Nusap1的表達(dá)，可以明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，同時可以增強(qiáng)癌細(xì)胞對表阿霉素的敏感性[6]。Nusap1還可以通過上調(diào)Wnt /β-catenin信號通路促進(jìn)宮頸癌侵襲、轉(zhuǎn)移和腫瘤發(fā)生[7]。前期研究已證實，下瘀血湯有較好的抑制肝癌細(xì)胞體外生長的作用[8]，本研究在前期基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步觀察下瘀血湯對肝癌細(xì)胞裸鼠移植瘤增長及Nusap1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雌性BALB/c裸鼠(4～6周齡)32只，體質(zhì)量(200±20)g，購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2018-0008]，飼養(yǎng)于南通大學(xué)動物實驗中心，進(jìn)食配制基礎(chǔ)飼料。

1.2 藥品及試劑 下瘀血湯藥物組成：生大黃6 g，桃仁6.7 g，土鱉蟲11.6 g，由南通市中醫(yī)院制劑室煎制，藥液生藥含量為0.4 g/mL；肝癌HepG2細(xì)胞，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞資源中心；Nusap1及β-actin抗體，購自英國Abcam公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清，購自賽默飛世爾科技公司；胰蛋白酶，購自北京索萊寶科技有限公司；RNAiso Plus，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒，購自日本Takara公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒qPCR SYBR Green Master Mix，購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Nusap1引物設(shè)計由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，購自美國BD公司；RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、麗春紅染色液，購自北京碧云天生物技術(shù)公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器 FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)儀(美國BIO-RAD公司)；CO2培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞基培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，并置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞長至約80%～90%時，采用胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心機(jī)重懸后進(jìn)行傳代，傳代約第3代后，當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)期，生長狀態(tài)良好，將對數(shù)期細(xì)胞收集。

1.4.2 建立肝癌移植裸鼠模型及分組 將0.2 mL(濃度約5×107個/mL)的HepG2細(xì)胞注射于所有裸鼠右腋皮下。接種后的裸鼠在無菌環(huán)境下飼養(yǎng)，每日記錄觀察成瘤情況。當(dāng)皮下腫瘤體積>50 mm3時，達(dá)到成瘤標(biāo)準(zhǔn)[9]。將造模成功的20只裸鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、下瘀血湯低劑量組、下瘀血湯中劑量組、下瘀血湯高劑量組，每組5只。

1.4.3 灌胃 分組后開始灌胃。下瘀血湯低、中、高劑量組分別予0.15、0.3、0.6 g/20 g下瘀血湯灌胃(具體給藥劑量通過體表面積換算為人小鼠等效劑量為高劑量組，中、低劑量組分別稀釋2倍、4倍[10])，灌胃容積0.2 mL/10 g。對照組予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃。灌胃均每日2次(8：00，18:00)，連續(xù)15 d。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 成瘤情況 灌胃期間每日觀察祼鼠精神活動及飲食、大小便情況。每3 d測量腫瘤體積，腫瘤體積=1/2×長徑×短徑×短徑[11]。15 d后停止灌胃，脊椎脫臼法處死裸鼠，割除瘤體，稱取瘤體質(zhì)量。

1.5.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測移植瘤細(xì)胞凋亡 腫瘤組織使用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，切取瘤體組織1/4大小，提取瘤體組織細(xì)胞，按照細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明，依次加入PE Annexin Ⅴ和7-AAD試劑，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.5.3 qRT-PCR檢測Nusap1基因mRNA表達(dá) 切取瘤體組織1/4大小，按照RNAiso Plus說明書，通過研磨，提取瘤體組織細(xì)胞的總RNA。在37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃ 1 min的條件下按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。最后通過SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒行qRT-PCR檢測Nusap1基因mRNA的表達(dá)量。內(nèi)參基因為β-actin。通過Power=2-△△CT值計算相對表達(dá)量，隨后采用Power值行統(tǒng)計學(xué)分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5.4 免疫印跡(Western Blot)實驗檢測Nusap1蛋白表達(dá) 取瘤體組織1/4大小，將腫瘤組織置于含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液中，于冰上裂解，離心取得蛋白。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白含量，稀釋蛋白至濃度5～10 μg/L。配制分離膠和積層膠，待凝固后進(jìn)行凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜成功后予麗春紅染色顯示條帶，剪下晾干。常溫封閉液封閉膜2 h后，加入Nusap1抗體(抗體稀釋比例1∶2 000)，4 ℃冰箱過夜，第2 d加入HRP標(biāo)記的二抗，暗室內(nèi)發(fā)光、顯影、定影。

2 結(jié) 果

2.1 裸鼠情況 初始裸鼠共32只，因飼養(yǎng)不當(dāng)死亡2只，種植移植瘤后提前死亡4只，因移植瘤生長緩慢未達(dá)實驗標(biāo)準(zhǔn)而未納入后續(xù)實驗6只，最終造模成功裸鼠20只，每組5只。

2.2 各組裸鼠移植瘤體積比較 見表2。

由表2可見，灌胃第6、9 d，各組裸鼠移植瘤體積組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；灌胃第12 d，下瘀血湯中、高劑量組裸鼠移植瘤體積低于對照組(P<0.05)；灌胃第15 d，下瘀血湯低、中、高劑量組裸鼠移植瘤體積低于對照組(P<0.05)。灌胃第12、15 d，下瘀血湯低、中、高劑量組裸鼠移植瘤體積組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組裸鼠移植瘤體積比較

2.3 各組裸鼠移植瘤平均質(zhì)量比較 見表3。

表3 各組裸鼠移植瘤平均質(zhì)量比較

由表3可見，下瘀血湯低、中、高劑量組裸鼠移植瘤平均質(zhì)量均低于對照組(P<0.05)，下瘀血湯中、高劑量組裸鼠移植瘤平均質(zhì)量均低于下瘀血湯低劑量組(P<0.05)，下瘀血湯高劑量組裸鼠移植瘤平均質(zhì)量低于下瘀血湯中劑量組(P<0.05)。見封2，圖1。

2.4 各組裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡情況 見圖2、表4。

圖2 各組裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡情況

表4 各組裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡率比較

由圖2可見，下瘀血湯低、中、高劑量組均可見大量被染色的凋亡細(xì)胞，且隨著藥物濃度的增加，凋亡細(xì)胞越多。由表4可見，下瘀血湯低、中、高劑量組移植瘤細(xì)胞凋亡率高于對照組(P<0.05)，下瘀血湯高劑量組移植瘤細(xì)胞凋亡率高于下瘀血湯低、中劑量組(P<0.05)。下瘀血湯低、中劑量組移植瘤細(xì)胞凋亡率組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 各組裸鼠Nusap1 mRNA相對表達(dá)量比較 見表5。

表5 各組裸鼠Nusap1 mRNA相對表達(dá)量比較

由表5可見，下瘀血湯低、中、高劑量組Nusap1 mRNA相對表達(dá)量均低于對照組(P<0.05)，下瘀血湯高劑量組Nusap1 mRNA相對表達(dá)量低于下瘀血湯低劑量組(P<0.05)。下瘀血湯低、中劑量組Nusap1 mRNA相對表達(dá)量組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，下瘀血湯中、高劑量組Nusap1 mRNA相對表達(dá)量組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.6 各組裸鼠Nusap1蛋白表達(dá) 見圖3。

由圖3可見，下瘀血湯低、中、高劑量組可以抑制Nusap1蛋白的表達(dá)，且隨著下瘀血湯用藥濃度的增加，這種抑制作用逐漸增強(qiáng)。

圖3 各組裸鼠Nusap1蛋白表達(dá)

3 討 論

肝癌被發(fā)現(xiàn)時多處于中晚期，失去手術(shù)機(jī)會，放化療、介入治療又難以取得很好的療效[12]。隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，中醫(yī)藥與現(xiàn)代分子生物學(xué)相結(jié)合的研究模式越來越受到關(guān)注。中醫(yī)藥在治療肝癌方面積累了豐富的臨床經(jīng)驗，相對于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，在控制病情進(jìn)展、延長生存期方面具有獨特優(yōu)勢。在肝癌的中醫(yī)證型中，血瘀證是最主要的證型，血瘀貫穿了肝癌發(fā)展的始終[13]?；钛龇ㄊ歉伟┲委煹幕局蝿t。活血化瘀法可以降低血液黏稠度，抑制腫瘤瘤栓的形成，改善腫瘤患者局部及全身的高凝狀態(tài)，改善微循環(huán)，改善組織供氧，防止低氧狀態(tài)下腫瘤的惡性增殖[14]。下瘀血湯為活血化瘀劑，由大黃、桃仁、土鱉蟲組成。方中大黃逐瘀通經(jīng)；桃仁活血化瘀；土鱉蟲除瘀消積。全方共奏破瘀散結(jié)、通利臟腑之效?，F(xiàn)代藥理研究證實，大黃、桃仁、土鱉蟲均有較好的抗腫瘤作用[15-18]；下瘀血湯對膽堿蛋氨酸缺乏誘導(dǎo)的小鼠非酒精性脂肪性肝炎有較好的抑制作用，該作用可能與調(diào)控巨噬細(xì)胞NLRP6的表達(dá)有關(guān)[19]；下瘀血湯在抗肝纖維化方面具有獨特的作用，主要機(jī)制包括抑制星狀細(xì)胞激活，誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡，抑制血管新生，調(diào)控巨噬細(xì)胞功能，促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡及抗氧化等[20]；下瘀血湯還可以抑制胃癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長[21]。

Nusap1是一種高表達(dá)于多種癌細(xì)胞的腫瘤標(biāo)志物。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Nusap1的過度表達(dá)是一種潛在的預(yù)后不良標(biāo)志物[22-23]。因此，對Nusap1檢測為臨床腫瘤的定位診斷、預(yù)后評估及靶向治療提供了有利條件。目前，對于腫瘤患者仍缺乏有效的治療方法，在分子水平的研究有助于轉(zhuǎn)化到臨床診斷治療中，進(jìn)而造?；颊摺?/p>

前期研究表明，下瘀血湯對于肝癌HepG2細(xì)胞生長有抑制作用[8]。本研究結(jié)果顯示，下瘀血湯能較好地抑制肝癌HepG2移植瘤的生長，且下瘀血湯濃度越高，抑制作用越明顯，抑制腫瘤生長呈濃度依賴性。下瘀血湯低劑量組抑制作用較下瘀血湯中、高劑量組效果略差，但隨著用藥時間的延長，下瘀血湯低劑量組用藥也可以產(chǎn)生較好的抑制腫瘤生長的作用。下瘀血湯可以較好地促進(jìn)移植瘤細(xì)胞的凋亡，且下瘀血湯高劑量組促凋亡作用最強(qiáng)，呈現(xiàn)出藥物劑量和效應(yīng)相關(guān)性。Western Blot及qRT-PCR實驗表明，下瘀血湯可抑制腫瘤組織中Nusap1蛋白及mRNA的表達(dá)，抑制作用與用藥濃度相關(guān)，濃度越高，抑制作用越明顯。由此我們得出結(jié)論，下瘀血湯可抑制肝癌HepG2裸鼠移植瘤的生長，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，此作用與抑制Nusap1的表達(dá)密切相關(guān)。