凌玉金 唐玉蓮 倪安妮 廖成傳 劉明慧 梁禎妮 李曙波 陸瑞群 李根亮

右江民族醫(yī)學(xué)院,廣西百色市 533000

肝細(xì)胞癌是威脅人類健康最主要的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一[1-2]。據(jù)最新的中國(guó)惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析報(bào)告，我國(guó)肝細(xì)胞癌發(fā)病率已居惡性腫瘤第4位[3]。外泌體是細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡，其可通過(guò)血液等體液遠(yuǎn)距離運(yùn)輸，靶向作用于細(xì)胞和組織，參與抗原提呈、天然免疫以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等各方面。劉樹(shù)業(yè)[4]在HCC中發(fā)現(xiàn)，外泌體可通過(guò)調(diào)控HCC腫瘤微環(huán)境的耐受情況影響機(jī)體的免疫反應(yīng)。袁正宏[5]在病毒感染機(jī)體的過(guò)程中亦證明了，外泌體在激活機(jī)體免疫反應(yīng)等方面的突出作用?？梢?jiàn)，外泌體在HCC組織中的免疫反應(yīng)作用逐漸被發(fā)現(xiàn)。但是，外泌體參與HCC組織免疫反應(yīng)的機(jī)制機(jī)理還有很多地方不清楚，特別是血液相關(guān)外泌體在HCC腫瘤組織天然免疫方面的作用目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

據(jù)此，本研究以HCC模型小鼠的瘤體組織和癌旁肝組織為實(shí)驗(yàn)材料，提取各組織中的總RNA，通過(guò)RNA-seq和生物信息學(xué)手段，分析HCC組織中參與天然免疫反應(yīng)的肝細(xì)胞癌源血液相關(guān)外泌體差異表達(dá)基因及其功能，并用RT-qPCR驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因分析，探討HCC來(lái)源血液相關(guān)外泌體組分參與天然免疫反應(yīng)的可能機(jī)制，為臨床腫瘤預(yù)防和診治提供幫助作用。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物模型構(gòu)建和樣本獲取 鼠齡7周、體重22～25g的健康昆明小鼠100只，隨機(jī)分成2組，即肝癌模型小鼠組(60只)和對(duì)照組(40只)。對(duì)照組用于判斷肝癌模型小鼠建立是否成功。方法：給予肝癌模型小鼠組每只小鼠雙前肢腋下接種0.2ml肝癌細(xì)胞系H22細(xì)胞(指數(shù)增長(zhǎng)期細(xì)胞，細(xì)胞懸液濃度為105個(gè)/ml)，對(duì)照組同法生理鹽水注射。正常飼養(yǎng)4周后，分別取成瘤小鼠瘤體組織和癌旁肝組織，各自等量混合制成混合樣本。

1.2 樣本RNA提取及RNA-seq 采用RNA提取試劑盒(Invitrogen，中國(guó)上海)，分別提取瘤體組織和癌旁肝組織樣本中總RNA，送公司進(jìn)行RNA-seq分析以獲得兩類樣本中差異表達(dá)基因。RNA-seq質(zhì)量檢測(cè)及clean reads篩選按常規(guī)程序完成。差異表達(dá)基因以兩類樣本中同一基因之間的RPKF值(每百萬(wàn)測(cè)序堿基中或每千個(gè)轉(zhuǎn)錄子測(cè)序堿基中所包含的測(cè)序片斷數(shù))比值≥2或≤0.5，且FDR(錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率)值≤0.05的基因?yàn)橛薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 HCC源血液相關(guān)外泌體差異表達(dá)基因的篩選 以“blood、exosome or exosomal、protein、Innate immunity和Mus musculus”作為關(guān)鍵詞，在NCBI中的Nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行HCC源血液相關(guān)外泌體基因檢索。將檢索結(jié)果與測(cè)序數(shù)據(jù)中的差異表達(dá)基因進(jìn)行比對(duì)，篩選出差異表達(dá)的HCC源血液相關(guān)外泌體基因。

1.4 參與天然免疫反應(yīng)的HCC源血液相關(guān)外泌體差異表達(dá)基因的篩選 利用DAVID 6.8軟件對(duì)差異表達(dá)的HCC源血液相關(guān)外泌體基因進(jìn)行功能富集，篩選出參與天然免疫反應(yīng)的HCC源血液相關(guān)外泌體差異表達(dá)基因，以FDR≤0.05的基因?yàn)橛薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 參與天然免疫反應(yīng)的HCC源血液相關(guān)外泌體差異表達(dá)基因的功能分析 利用DAVID 6.8軟件對(duì)參與天然免疫反應(yīng)的HCC源血液相關(guān)差異表達(dá)基因進(jìn)行在線基因注釋及功能富集，以進(jìn)行GO和KEGG分析。

1.6 參與天然免疫反應(yīng)的HCC源血液相關(guān)差異表達(dá)基因的編碼蛋白互作分析 通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)參與天然免疫反應(yīng)的HCC源血液相關(guān)差異表達(dá)基因的編碼蛋白進(jìn)行互作分析，以評(píng)價(jià)差異基因在分布和功能上的相關(guān)性。

1.7 SNV/INDEL與基因表達(dá)的相關(guān)性分析 利用Excel軟件對(duì)參與天然免疫反應(yīng)的HCC源血液相關(guān)差異表達(dá)基因中出現(xiàn)的單核苷酸位點(diǎn)變異(Single nucleotide variants，SNV)及核苷酸插入/刪除(INDEL)情況進(jìn)行分析，探討其多態(tài)性與基因表達(dá)異常的相關(guān)性。

1.8 RT-qPCR驗(yàn)證 隨機(jī)選擇4個(gè)參與天然免疫反應(yīng)的HCC源血液相關(guān)差異表達(dá)基因進(jìn)行RT-qPCR分析，內(nèi)參基因?yàn)棣?actin。引物采用Blast-primer軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，由上海生工公司合成。

2 結(jié)果

2.1 參與天然免疫反應(yīng)的HCC源血液相關(guān)外泌體差異表達(dá)基因的篩選結(jié)果 通過(guò)篩選比對(duì)，在健康肝組織和癌旁肝組織中發(fā)現(xiàn)了81個(gè)參與天然免疫反應(yīng)的差異表達(dá)的HCC來(lái)源血液相關(guān)外泌體基因。隨機(jī)選取的4個(gè)差異表達(dá)基因RT-qPCR分析結(jié)果與RNA-seq結(jié)果中的表達(dá)趨勢(shì)一致，見(jiàn)圖1。RT-qPCR引物見(jiàn)表1。

圖1 RT-qPCR與RNA-seq檢測(cè)參與天然免疫反應(yīng)的HCC來(lái)源血液相關(guān)外泌體基因的表達(dá)情況比較

表1 基因RT-qPCR引物

2.2 參與天然免疫反應(yīng)的HCC源血液相關(guān)外泌體差異表達(dá)基因的功能 對(duì)81個(gè)差異表達(dá)基因功能富集，共富集到10個(gè)生物學(xué)過(guò)程(BP)、4個(gè)細(xì)胞組分(CC)、3個(gè)分子功能(MF)和2個(gè)KEGG通路(KEGG)。進(jìn)一步分析這些基因功能，發(fā)現(xiàn)它們主要富集在天然免疫反應(yīng)(39個(gè)基因)、血液凝固(25個(gè)基因)、炎癥反應(yīng)(18個(gè)基因)、受體結(jié)合(16個(gè)基因)、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性(16個(gè)基因)、絲氨酸型肽酶活性(12個(gè)基因)等方面，以及補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)(33個(gè)基因)等信號(hào)通路上，見(jiàn)圖2和圖3。

2.3 參與天然免疫反應(yīng)的HCC源血液相關(guān)外泌體差異表達(dá)基因的編碼蛋白互作 參與天然免疫反應(yīng)的HCC來(lái)源血液相關(guān)外泌體基因的編碼蛋白互作情況也表明了這些基因功能密切相關(guān)，見(jiàn)圖4。

2.4 SNV/INDEL與基因表達(dá)的相關(guān)性 SNV/INDEL的分析結(jié)果顯示，參與天然免疫反應(yīng)的HCC來(lái)源的81個(gè)血液相關(guān)外泌體基因共發(fā)生了387個(gè)SNV和8個(gè)INDEL位點(diǎn)的改變。這些基因位點(diǎn)的改變主要發(fā)生在基因的6個(gè)部位，即外顯子區(qū)(exonic)、內(nèi)含子區(qū)(intronic)、基因間區(qū)(intergenic)、基因下游區(qū)(downstream)、基因上游區(qū)(upstream)及拼接區(qū)(splicing)，其中外顯子區(qū)、內(nèi)含子區(qū)及基因間區(qū)3個(gè)區(qū)域發(fā)生這些位點(diǎn)多態(tài)性概率最大，見(jiàn)圖5。

圖2 參與天然免疫反應(yīng)的HCC源血液相關(guān)外泌體差異表達(dá)基因的功能

圖3 天然免疫反應(yīng)的HCC源血液相關(guān)外泌體差異表達(dá)基因參與的補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)信號(hào)通路

圖4 參與天然免疫反應(yīng)的HCC來(lái)源血液相關(guān)外泌體差異表達(dá)基因的編碼蛋白互作

圖5 參與天然免疫反應(yīng)的HCC來(lái)源血液相關(guān)外泌體基因的SNV和INDEL分布

3 討論

外泌體是遠(yuǎn)程細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的重要載體。在腫瘤組織中，新腫瘤的發(fā)生發(fā)展與富含多種來(lái)自親代腫瘤活性成分的腫瘤源外泌體有緊密聯(lián)系[6-7]。腫瘤源外泌體通過(guò)樹(shù)突狀細(xì)胞將腫瘤特異性抗原提呈給CD8+T細(xì)胞激發(fā)殺傷作用，在抗腫瘤免疫中起重要作用[8]?？梢?jiàn)，外泌體與機(jī)體的免疫反應(yīng)有密切聯(lián)系。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)81個(gè)參與天然免疫的HCC源血液相關(guān)外泌體基因。這些基因富集到的功能主要包括天然免疫反應(yīng)、血液凝固、炎癥反應(yīng)、受體結(jié)合等。這表明，我們的研究與其他研究者有同樣的發(fā)現(xiàn),并且我們?cè)诟患降墓δ苤?，還發(fā)現(xiàn)其中有33個(gè)HCC源血液相關(guān)外泌體差異表達(dá)基因還參與了補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)信號(hào)通路。

凝血系統(tǒng)作為機(jī)體免疫應(yīng)答的重要組成部分發(fā)揮功能[9]。病原體感染機(jī)體會(huì)同時(shí)激活凝血系統(tǒng)引起血液凝固，血液凝固會(huì)進(jìn)一步限制病原體入侵機(jī)體。生物普遍存在的補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)系統(tǒng)以維持天然免疫的激活[9]。這表明補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)與天然免疫有很密切的關(guān)系。但補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)與腫瘤源性外泌體的相互作用的報(bào)道較少。有報(bào)道，肺癌病人外泌體中的補(bǔ)體蛋白C4a在血漿內(nèi)的表達(dá)量明顯高于良性病人[10]。我們研究發(fā)現(xiàn)33個(gè)基因參與了補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)信號(hào)通路，這進(jìn)一步補(bǔ)充了腫瘤源性外泌體與補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)的密切關(guān)系。

那么，血液相關(guān)外泌體基因在腫瘤天然免疫中具體有何作用？Huber等[11]發(fā)現(xiàn)血液中血小板源性外泌體對(duì)凝血途徑的激活作用是外泌體在凝血級(jí)聯(lián)系統(tǒng)中的主要表現(xiàn)形式之一。約50%惡性腫瘤患者和90%惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的患者凝血系統(tǒng)指標(biāo)發(fā)生不同程度的異常[12]。腫瘤患者機(jī)體凝血、抗凝纖溶系統(tǒng)發(fā)生失衡，導(dǎo)致血液處于高凝狀態(tài)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)的肝細(xì)胞癌源血液相關(guān)外泌體組分，從富集到的功能基因的數(shù)量上看，HCC源血液相關(guān)外泌體組分很可能主要以受體結(jié)合、絲氨酸型肽酶催化活性等，通過(guò)補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)信號(hào)途徑，參與HCC組織中的天然免疫反應(yīng)。在遠(yuǎn)離原病灶的組織中通過(guò)激活補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)信號(hào)途徑參與防御癌細(xì)胞擴(kuò)散和入侵的天然免疫反應(yīng)抑制癌細(xì)胞的增殖。我們進(jìn)行的差異基因的SNV/INDEL的分析表明，基因的多態(tài)性還很可能在HCC中扮演著重要的調(diào)控作用。

綜上所述，本研究探索了HCC來(lái)源血液相關(guān)外泌體基因參與天然免疫的可能機(jī)制，發(fā)現(xiàn)HCC源血液相關(guān)外泌體組分可能主要以受體結(jié)合、絲氨酸型肽酶活性等，通過(guò)補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)信號(hào)途徑參與天然免疫反應(yīng)，從而在抑制癌細(xì)胞的增殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用。