付子琳，陳 林，李 娜，徐曉鋒，張力莉

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021）

灘羊是我國西北地區(qū)獨(dú)特的綿羊品種，以寧夏中、北部為中心產(chǎn)區(qū)，年存欄規(guī)模約300 萬只。瘤胃是反芻動(dòng)物最主要的消化器官，其菌群結(jié)構(gòu)影響瘤胃的發(fā)酵功能[1]。Owens 等[2]研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃微生物對攝入飼料進(jìn)行代謝作用，其代謝產(chǎn)物和微生物蛋白將作為反芻動(dòng)物的能量和蛋白質(zhì)的最主要來源。與此同時(shí)，原蟲吞噬行為、自溶現(xiàn)象以及高的脫氨基活性會(huì)造成氮的無效利用。因此，改善瘤胃菌群結(jié)構(gòu)對促進(jìn)反芻動(dòng)物生長健康、提高其纖維降解和飼料轉(zhuǎn)化效率具有重要意義。瘤胃微生物主要包括纖毛蟲、真菌及細(xì)菌，其中，真菌占總量的5%～20%。瘤胃真菌含有消化植物組織所需要的酶，包括纖維素酶、木聚糖酶以及其他水解酶等，主要附著于纖維類植物飼料表面，參與復(fù)雜碳水化合物的初步降解。雖然真菌占瘤胃微生物的比例不多，但真菌個(gè)體較大，且其復(fù)雜性以及酶活性在消化纖維中起主要作用[3-5]。

目前能夠檢測并定義的瘤胃厭氧真菌主要包括新美鞭菌屬、盲腸鞭菌、梨囊鞭菌屬、Anaeromyces屬、Orpinomyces屬及Cyllamyces屬6 個(gè)屬[6]。不同種屬微生物在瘤胃內(nèi)占據(jù)不同生態(tài)位，其組成與種群密度隨飼喂而改變[7]。近年來，灘羊的傳統(tǒng)生產(chǎn)方式由放牧轉(zhuǎn)為舍飼，由采食荒漠及干旱草原牧草為主轉(zhuǎn)向以人工牧草和作物秸桿以及補(bǔ)充精料為主。為此本研究基于ITS 測序分析技術(shù)首次檢測飼養(yǎng)方式對灘羊瘤胃真菌菌群結(jié)構(gòu)與多樣性的影響，為灘羊的營養(yǎng)調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇體重（30.12±3.23）kg、體況健康的9 月齡去勢灘羊24 只，隨機(jī)分為放牧組和舍飼組，放牧組灘羊于2017 年9 月份在鹽池寧鑫生態(tài)牧場全天放牧，為期3 個(gè)月，可自由采食草場牧草（沙打旺、胡枝子、苦豆子、檸條、甘草等），每天放牧13 h（07:00—20:00），無補(bǔ)飼；舍飼組飼喂混合日糧，原料成分及營養(yǎng)成分見表1，每天早晚飼喂2 次，自由采食。

1.2 樣品采集與處理 在試驗(yàn)灘羊12 月齡時(shí)，2 組隨機(jī)各取5 只灘羊進(jìn)行屠宰，采集瘤胃內(nèi)容物于50 mL 離心管中，放置于-80℃冰箱（DW-HL528S，中科美菱）中凍存，用于瘤胃真菌菌群分析。共10 個(gè)樣品，其中放牧組5 個(gè)（G12-1、G12-2、G12-3、G12-4、G12-5），舍飼組5個(gè)（R12-1、R12-2、R12-3、R12-4、R12-5）。

表1 舍飼組灘羊日糧組成及營養(yǎng)成分（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.3 樣品DNA 提取與測序 運(yùn)用試劑盒法提取樣本總DNA，試劑盒由南京建成生物研究所提供。樣本總DNA 提取后，利用PCR 儀（ETC811，EASTWIN），用帶有barcode 的特異引物擴(kuò)增ITS rDNA 的ITS2 區(qū)域。引物序列為KYO2F：5′-GATGAAGAACGYAGYRAA-3′；ITS4R：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR 反應(yīng)體系為50 μL：DNA 1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.5 μL，2 mmol/L dNTPs 5μL，25 mmol/L MgSO43 μL，10×Buffer KOD 5 μL，KOD 酶1 μL，ddH2O（無酶水）32 μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，98℃變性10 s，退火30 s，退火溫度為62℃，68℃延伸30 min，共32個(gè)循環(huán)；最后68℃延伸5 min。使用AMPure XP Beads對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，用ABI StepOnePlus Real-Time PCR System（Life Technologies）對其純化產(chǎn)物進(jìn)行定量，引物序列同上，根據(jù)illumina Hiseq2500 的PE250 模式pooling 上機(jī)測序。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用Excel 2016 進(jìn)行初步處理，采用 SAS 8.2 統(tǒng)計(jì)軟件中的完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析進(jìn)行組間差異顯著性比較；菌群豐度采用Metastats 軟件進(jìn)行分析。結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，P<0.05 為差異顯著，P<0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 樣品測序深度分析 如圖1 所示，當(dāng)測序深度超過5 000 reads 時(shí)，曲線趨于平緩，各樣品達(dá)到飽和狀態(tài)，表明本試驗(yàn)的測序深度足以覆蓋各樣品中大多數(shù)微生物，測序深度增加已經(jīng)不影響物種多樣性，樣品Shannon 曲線高度沒有明顯組間差異。

圖1 Shannon 曲線

2.2 瘤胃真菌OTUs 比較 經(jīng)Illumina Hiseq 測序結(jié)束后，除去低質(zhì)序列，通過序列拼接，應(yīng)用Mothur，根據(jù)97% 的序列相似度，對序列進(jìn)行OTU 劃分。根據(jù)OTU 聚類分析結(jié)果，分析不同樣品的聚類信息，依照其共有、特有的OTU 信息繪制韋恩圖（Venn graph）。如圖2 所示，放牧組（G12）灘羊瘤胃真菌OTU 總數(shù)有347 個(gè)，舍飼組（R12）OTU 總數(shù)有322 個(gè)，2 組共有的OTU 數(shù)量為169。

2.3 PCoA 分析 基于樣本間的加權(quán)（Weighted Unifrac）和非加權(quán)（Unweighted Unifrac）數(shù)據(jù)結(jié)果，繪制出PCoA（Principal Coordinates Analysis）圖形，直觀顯示不同環(huán)境樣品中微生物進(jìn)化上的相似性及差異性。分析結(jié)果中，樣品越相似，反映在PCoA 圖中的距離越近，而且不同環(huán)境間的樣品可能表現(xiàn)出各自聚集的分布情況。

圖2 試驗(yàn)灘羊瘤胃真菌菌群韋恩圖

如圖3-a 所示，未加權(quán)僅考慮物種有無變化時(shí)，放牧組（G12）5 個(gè)樣本相對集中，舍飼組（R12）1、3、5 號(hào)樣本相對集中，而2 號(hào)、4 號(hào)在第二主成分縱向上樣本距離較大，與組內(nèi)其他樣本相似性較??；而加權(quán)后（圖3-b）同時(shí)考慮了物種有無和豐度的變化，放牧組中1 號(hào)與其他4 個(gè)樣本差異較大，舍飼組內(nèi)樣本差異性較大。

圖3 PCoA 分析

2.4 瘤胃真菌Alpha 多樣性分析 由表2 可知，放牧組的Chao1 和ACE 值均顯著高于舍飼組，說明放牧組灘羊瘤胃真菌豐富度高于舍飼組；而Shannon 和Simpson指數(shù)組間差異不顯著，表明當(dāng)綜合物種豐富度和均勻度比較時(shí)，不同飼養(yǎng)方式對成年灘羊瘤胃真菌多樣性影響不顯著。

表2 樣品在0.03 距離下的Alpha 豐富程度

2.5 瘤胃真菌菌群結(jié)構(gòu)

2.5.1 門水平 由表3 可知，放牧組中鑒定出6 個(gè)門，舍飼組中鑒定出4 個(gè)門，含量在5% 以上的優(yōu)勢菌門均為新麗鞭毛菌門（Neocallimastigomycota）和子囊菌門（Ascomycota），含量超過90%；含量在0.5%～5%的次優(yōu)菌門均為擔(dān)子菌門（Basidiomycota） 和1 種未注釋菌門；此外，僅在放牧組中檢測出微量的毛霉門（Mucoromycota）和被孢霉門（Mortierellomycota）。灘羊瘤胃真菌不同菌門在不同飼養(yǎng)方式下均無顯著差異，但放牧組鑒定出的灘羊瘤胃菌門多于舍飼組。

表3 灘羊瘤胃真菌結(jié)構(gòu)門水平的變化

2.5.2 屬水平 放牧組共鑒定出65 個(gè)屬，舍飼組共鑒定出58 個(gè)屬，放牧組多于舍飼組。2 組屬水平上的優(yōu)勢菌（豐度在5% 以上）、次優(yōu)菌屬（豐度均在0.5%～5%）及差異菌屬見表4。本試驗(yàn)中，差異菌屬共有6 種，其中優(yōu)勢菌屬均無顯著性差異，次優(yōu)菌屬有4種。放牧組共鑒定出3 個(gè)優(yōu)勢菌屬，分別為梨囊鞭菌屬（Piromyces）、Kazachstania屬及1 個(gè)未注釋菌屬；9個(gè)次優(yōu)菌屬分別為赤霉菌屬（Gibberella）、附球菌屬（Epicoccum）、Naganishia屬、線黑粉菌屬（Filobasidium）、酵母屬（Saccharomyces）、鏈格孢屬（Alternaria）、Meyerozyma屬、Papiliotrema屬、未注釋新美鞭菌科（Neocallimastigaceae-NA）、新美鞭菌屬（Neocallimastix）及Pleonectria屬；其中放牧組Naganishia屬、線黑粉菌屬（Filobasidium）和酵母屬（Saccharomyces）3 個(gè)菌屬含量極顯著高于舍飼組。舍飼組共鑒定出4 個(gè)優(yōu)勢菌群，分別為梨囊鞭菌屬（Piromyces）、Kazachstania、1 個(gè)未注釋菌屬及附球菌屬（Epicoccum）；8 個(gè)次優(yōu)菌屬分別為鏈格孢屬（Alternaria）、Meyerozyma屬、未注釋新美鞭菌科（Neocallimastigaceae-NA）、新美鞭菌屬（Neocallimastix）、黃絲曲霉屬（Talaromyces）、節(jié)擔(dān)菌屬（Wallemia）、雙足囊菌屬（Dipodascus）及Paraphaeosphaeria屬；其中，節(jié)擔(dān)菌屬（Wallemia）含量極顯著高于放牧組；Paraphaeosphaeria屬含量較放牧組有升高趨勢（P>0.05）。此外，放牧組中Pleonectria屬含量顯著高于舍飼組；而平臍蠕孢屬（Bipolaris）和裂褶菌屬（Schizophyllum）含量有升高趨勢（P>0.05）；香蘑屬（Lepista）含量顯著降低；而盲腸鞭菌屬（Caeco myces）含量有降低趨勢（P>0.05)。

表4 灘羊瘤胃真菌結(jié)構(gòu)屬水平的變化

3 討 論

3.1 飼養(yǎng)方式對灘羊瘤胃真菌菌群豐富度影響 厭氧真菌在瘤胃微生物占比較低且生長速度慢，與細(xì)菌相比，在瘤胃系統(tǒng)中處于劣勢。但真菌能夠與細(xì)菌競爭生長環(huán)境并存活，應(yīng)當(dāng)具備其特有的功能[8]。瘤胃真菌假根可深入刺穿到植物細(xì)胞壁角質(zhì)層內(nèi)，利用酶對植物細(xì)胞壁進(jìn)行分解。雖然目前研究表明植物纖維主要由瘤胃細(xì)菌降解，但是真菌能夠首先植入纖維組織內(nèi)部進(jìn)行反應(yīng)[9-10]。本試驗(yàn)中，結(jié)合OTU 比較以及Alpha 多樣性Chao1和ACE 指數(shù)的分析可以看出，放牧組瘤胃真菌豐富度顯著高于舍飼組。Grenet 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，與淀粉含量較高的飼料相比，木質(zhì)素含量較高的飼料更有利于厭氧真菌生長，而且真菌會(huì)選擇性地附著于纖維成分。孫云章等[12]采用體外厭氧共培技術(shù)發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)木直扔欣诹鑫刚婢屠w維降解細(xì)菌在發(fā)酵前期建立起相對穩(wěn)定的共培養(yǎng)體系；但隨著精料比例的增大，真菌數(shù)量逐漸降低直到消失，細(xì)菌數(shù)量逐漸上升，同時(shí)系統(tǒng)的產(chǎn)氣量顯著增加。Belanche 等[13]研究表明，與高淀粉日糧相比，瘤胃細(xì)菌真菌的豐富度在奶牛采食高中性洗滌纖維日糧時(shí)豐富度更高，且纖維降解菌的濃度顯著增加。本試驗(yàn)中，采食相對較高含量纖維的放牧組灘羊瘤胃真菌豐富度顯著增加，與前人結(jié)果相一致。

3.2 飼養(yǎng)方式對瘤胃真菌菌群結(jié)構(gòu)的影響 反芻動(dòng)物所攝入的營養(yǎng)物質(zhì)大部分是進(jìn)入瘤胃后通過瘤胃微生物發(fā)酵進(jìn)而吸收的[14]，因此日糧的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)影響瘤胃的發(fā)酵功能，對瘤胃菌群結(jié)構(gòu)有所影響。多數(shù)瘤胃厭氧真菌屬都能分解纖維素，可產(chǎn)生纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶等，用于降解植物細(xì)胞壁[15]。而瘤胃不同屬厭氧真菌降解植物的能力有所不同，新美鞭菌屬（Neocallimastix）和梨囊鞭菌屬（Piromyces）降解秸稈的能力較強(qiáng)，而盲腸鞭菌屬（Caecomyces）相對較弱[16]。本試驗(yàn)中，梨囊鞭菌屬（Piromyces）在2 組中均是第一優(yōu)勢菌屬，雖然含量均值相差約14%，但并沒有顯著的組間差異；而盲腸鞭菌屬（Caecomyces）屬含量在舍飼組中有升高趨勢；其他纖維降解真菌，如未注釋新美鞭菌科（Neocallimastigaceae-NA）和新美鞭菌屬（Neocallimastix）組間差異也不顯著。Kazachstania及1 個(gè)未注釋菌屬作為2 個(gè)優(yōu)勢菌屬，其功能屬性還有待更深的研究。

Naganishia、線黑粉菌屬（Filobasidium）和酵母屬（Saccharomyces）3 個(gè)菌屬在放牧組中為次優(yōu)菌屬，且含量顯著高于舍飼組。這3 個(gè)菌屬均屬于酵母菌[17-18]。飼糧中添加酵母菌制劑可以改善反芻動(dòng)物能過改善瘤胃內(nèi)環(huán)境，且酵母屬（Saccharomyces）具有降解赭曲霉毒素的能力，有一些酵母菌還可以降解嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素[19-20]。

舍飼組節(jié)擔(dān)菌屬（Wallemia）和香蘑屬（Lepista）含量顯著升高。有研究表明，香蘑屬（Lepista）能夠較好地利用二糖，可以在偏酸性（pH=4.5）環(huán)境中生存[21]且存在腐生菌種[22]；節(jié)擔(dān)菌屬（Wallemia）通常生長在食物與室內(nèi)環(huán)境中，在腐生植物上也可以提取到[23]，節(jié)擔(dān)菌屬（Wallemia）在高溫發(fā)酵和腐熟階段均為優(yōu)勢菌群[24]。Paraphaeosphaeria屬在舍飼組內(nèi)有升高趨勢，但其在瘤胃中的功能作用報(bào)道較少，有待更進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

綜上所述，不同飼養(yǎng)方式對12 月齡灘羊瘤胃真菌菌群多樣性并未產(chǎn)生顯著影響，但放牧組灘羊瘤胃真菌豐富度顯著高于舍飼組；不同飼養(yǎng)方式對瘤胃真菌菌群結(jié)構(gòu)存在存在一定影響，其中差異菌屬有6 種，其中包含4 種次優(yōu)菌屬。