孟海藍(lán)，王嘉寧，朱連勤，朱風(fēng)華，陳 甫

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東青島 266109）

硒（Selenium，Se）是一種人和動(dòng)物所必需的微量元素，可提高機(jī)體免疫力、抗癌、抗氧化、抗應(yīng)激、延緩衰老及拮抗某些毒物等[1-2]。硒作為谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）等多種抗氧化酶的組成部分[3]，調(diào)節(jié)生命體的大部分抗氧化防御機(jī)制，硒酶的表達(dá)和活性受到硒的調(diào)控。硒缺乏使動(dòng)物機(jī)體硒酶表達(dá)和抗氧化能力下降，受到氧化應(yīng)激，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，蛋白質(zhì)和核酸受損[4]，進(jìn)而引發(fā)各種疾病，如禽的滲出性素質(zhì)、胰腺壞死和繁殖性能下降等[5-6]。因此，GPx 的活性和表達(dá)成為評(píng)價(jià)硒源抗氧化能力的最常用指標(biāo)。

殼聚糖硒是利用化學(xué)修飾的方法將殼聚糖硒化后得到的硒制劑[7]，能提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能[8]、免疫力[9]和抗氧化能力[10]，拮抗有毒元素[11]。這與許多研究[10-14]的結(jié)果相一致。目前，關(guān)于殼聚糖硒對(duì)雞抗氧化能力和硒酶表達(dá)的影響研究較少。因此，本試驗(yàn)旨在研究殼聚糖硒與亞硒酸鈉對(duì)雞抗氧化能力和硒酶mRNA 表達(dá)量的影響，以期為殼聚糖硒在雞生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選用1 日齡健康SPF 蛋雛雞135 羽，飼喂基礎(chǔ)日糧預(yù)試1 周后，隨機(jī)分成3 組，每組3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15 羽。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧；亞硒酸鈉組飼喂硒水平為0.15 mg/kg 的亞硒酸鈉日糧；殼聚糖硒組飼喂硒水平為0.15 mg/kg 的殼聚糖硒日糧。所有組自由采食與飲水，試驗(yàn)期28 d?；A(chǔ)飼糧組成與營(yíng)養(yǎng)成分含量參照美國(guó)NRC（1994）建議的雞的營(yíng)養(yǎng)需要量，如表1 所示。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成與營(yíng)養(yǎng)成分

1.2 樣品采集與處理 試驗(yàn)至14 d 和28 d，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選5 只雞，頸靜脈取血，3 000×g 離心15 min，取血清于保存-20℃，用于抗氧化指標(biāo)的測(cè)定；每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取3 只雞，切取肝臟1.0 g 立即放入液氮罐，用于硒酶mRNA 表達(dá)量的檢測(cè)。

1.3 抗氧化能力的測(cè)定 血清GPx 活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、總抗氧化能力（T-AOC）、過氧化物酶（POD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）水平的測(cè)定均按照南京建成工程研究所試劑盒說明進(jìn)行測(cè)定。

1.4 硒酶mRNA 表達(dá)量的測(cè)定

1.4.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 公布的雞的GPx-1、GPx-4和β-actin的基因序列中保守區(qū)域用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物（表2），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 目的基因熒光定量PCR 引物

1.4.2 RNA 提取與cDNA 合成 取0.2 g 肝臟用TRIZOL試劑（生工生物工程（上海）股份有限公司）提取總RNA，最終沉淀加入30 μL RNase-free H2O 溶解。然后根據(jù)cDNA 合成試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20℃保存。

1.4.3 熒光定量PCR 檢測(cè) 采用SYBR Green Ⅰ染料法，在熒光定量PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增和數(shù)據(jù)分析。PCR 反應(yīng)體系20 μL：2 μL Buffer（10×），2 μL SYBR Green Ⅰ（10×），200 μmol/L dNTP 2 μL、2 mmol/L MgCl22 μL、2 μL cDNA、250 nmol/L 上下游引物各1.0 μL、0.5 μL EX Taq 酶（5 U/μL）、ddH2O 7.5 μL。反應(yīng)程序：37℃預(yù)熱5 min，95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性3 s、56 ℃退火20 s、72℃延伸10 s、40 個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。采用相對(duì)定量法，以β-actin為內(nèi)標(biāo)，利用Ct 值計(jì)算不同處理組中GPx-1、GPx-4mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)采用平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用單因素方差分析比較不同組間的差異，采用最小顯著極差法（LSD）對(duì)差異顯著的數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較。P<0.05 為差異顯著，P<0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖硒對(duì)雞抗氧化功能的影響 如表3 所示，試驗(yàn)至14 d，補(bǔ)硒組血清GPX 和SOD 活性均顯著或極顯著高于對(duì)照組，殼聚糖硒組SOD 活性顯著高于亞硒酸鈉組，各組T-AOC 和MDA 含量、POD 和CAT 活性均差異不顯著。

試驗(yàn)至28 d，補(bǔ)硒組血清GPx 活性極顯著高于對(duì)照組，殼聚糖硒組血清GPx 活性極顯著高于亞硒酸鈉組，亞硒酸鈉組血清SOD 活性極顯著高于對(duì)照組和殼聚糖硒組，補(bǔ)硒組血清T-AOC 極顯著高于對(duì)照組。各組血清MDA 含量、POD 和CAT 活性均差異不顯著。

2.2 殼聚糖硒對(duì)雞肝臟硒酶mRNA 表達(dá)量的影響 如圖1、2 所示，補(bǔ)硒組肝臟GPx-1、GPx-4mRNA 表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，且14 d 時(shí)亞硒酸鈉組GPx-1表達(dá)量顯著高于殼聚糖硒組。

3 討 論

3.1 殼聚糖硒對(duì)雞抗氧化能力的影響 前期研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖硒能提高雞的采食量和體重，促進(jìn)雞的生長(zhǎng)，其應(yīng)用效果優(yōu)于亞硒酸鈉，但其機(jī)理未闡明（未發(fā)表）。本研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖硒能不同程度地提高雞血清GPx、SOD 活性和T-AOC 水平，但對(duì)血清POD 活性、CAT活性和MDA 水平無影響。方靜等[13]、Qin 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖硒能顯著提高GPx 和SOD 活性。這些結(jié)果均說明硒源能提高動(dòng)物的抗氧化能力。本試驗(yàn)中，與亞硒酸鈉相比，殼聚糖硒顯著提高了28 d 時(shí)血清GPx 活性，這與Qin 等[15]研究結(jié)果相似。GPx 既是反映硒生物學(xué)活性的主要硒酶之一，也是主要的抗氧化酶之一。因此，殼聚糖與亞硒酸鈉的結(jié)合增強(qiáng)了硒的生物學(xué)活性，殼聚糖硒在增強(qiáng)血清GPx 活性上優(yōu)于亞硒酸鈉，這也為殼聚糖硒能促進(jìn)雞的生長(zhǎng)且效果優(yōu)于亞硒酸鈉提供了理論依據(jù)。

圖1 殼聚糖硒對(duì)雞肝臟GPx-1 mRNA 表達(dá)量的影響

圖2 殼聚糖硒對(duì)肝細(xì)胞GPx-4 mRNA 表達(dá)量的影響

3.2 殼聚糖硒對(duì)雞肝臟GPx-1和GPx-4mRNA 表達(dá)量的影響 本研究結(jié)果表明，殼聚糖硒和亞硒酸鈉均能顯著提高肝臟GPx-1和GPx-4mRNA 的表達(dá)水平。Chen 等[16]和Qin 等[15]研究表明，硒能顯著提高GPx-1和（或）GPx-4mRNA 水平。而Wu 等[17]和Zoidis[18]等發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)硒后雞肝細(xì)胞和雞肝臟中GPx-4mRNA 水平無變化或降低。GPx 調(diào)控主要受到硒源及其水平的影響，而GPx-1在肝臟的分布較GPx-4多，在抗氧化反應(yīng)中發(fā)揮主要作用。因此，硒對(duì)GPx-1mRNA 的表達(dá)比GPx-4mRNA 表達(dá)的調(diào)控作用大。另外，本研究發(fā)現(xiàn)14 d 時(shí)亞硒酸鈉組肝臟GPx-1mRNA 表達(dá)水平顯著高于殼聚糖硒組，而2 組在28 d 的肝臟GPx-1、GPx-4mRNA表達(dá)水平無顯著差異，說明亞硒酸鈉短期內(nèi)提高硒酶GPx-1mRNA 表達(dá)的作用效果優(yōu)于殼聚糖硒。

表3 殼聚糖硒對(duì)蛋雞抗氧化功能的影響

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)條件下，殼聚糖硒能顯著提高蛋雛雞血清抗氧化酶活性和肝臟GPx-1和GPx-4mRNA 的表達(dá)，改善雞的抗氧化功能；殼聚糖硒和亞硒酸鈉在調(diào)控抗氧化酶活性和基因表達(dá)方面略有不同。