霍子?xùn)|，王 琪，蔣亞?wèn)|，李澤強(qiáng)，王 敬，肖 融*

（1.甘肅省畜牧技術(shù)推廣總站，甘肅蘭州 730030；2.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 602460；3.重慶市璧山區(qū)大興鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，重慶 402760；4.瀘州市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展促進(jìn)中心，四川瀘州 646000）

柚皮苷（Naringin）全稱4,5,7-三羥基-黃烷酮-7-鼠李糖葡萄糖苷，是一種二氫黃酮類化合物，天然存在于蕓香科植物葡萄柚、橘、橙的果皮和果肉中[1]。柚皮苷具有抗炎[2]、抗氧化[3]和調(diào)控脂肪代謝[4]等多種生物學(xué)功能，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和畜禽生產(chǎn)中均有較好的應(yīng)用價(jià)值。脂肪代謝及脂肪調(diào)控對(duì)于維持動(dòng)物健康和改良畜禽肉品質(zhì)具有十分重要的意義。柚皮苷作為一種新型飼料添加劑，能減少動(dòng)物脂肪沉積。Hagertheodorides 等[5]在Ross308 肉雞飼料中添加柚皮苷，發(fā)現(xiàn)腹部脂肪重量顯著下降，且胸肌中棕櫚酸含量降低，多不飽和脂肪酸含量升高。體外試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)柚皮苷可抑制3T3-L1 脂肪細(xì)胞的增殖和成脂分化[6-7]，但其是否通過(guò)促進(jìn)脂肪細(xì)胞凋亡來(lái)減少脂肪沉積的作用機(jī)制尚不明確。因此，本試驗(yàn)用不同濃度柚皮苷處理3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞，探討柚皮苷對(duì)脂肪細(xì)胞凋亡的影響，為柚皮苷在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料 3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；DMEM/F12 培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于Gibco 公司；胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、地塞米松和羅格列酮購(gòu)自Sigma 公司；柚皮苷（純度≥98.0%）購(gòu)自索萊寶公司；hoechst 染色試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；Binding Buffer 緩沖液、Annexin-V 和PI 購(gòu)自里來(lái)生物科技有限公司；RNA 提取試劑和RT-PCR 反應(yīng)試劑盒購(gòu)自TaKaRa 公司；RIPA 裂解液和BCA 試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；5×SDS 上樣緩沖液、Bax 抗體、APAF-1 抗體、GAPDH 抗體和山羊抗兔二抗購(gòu)自Cell Signaling Technology 公司；12%SDS-PAGE膠購(gòu)自invitrogen 公司；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自biobad 公司。

1.2 3T3-L1 細(xì)胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化 3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后，用DMEM 高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），在37℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為誘導(dǎo)分化，當(dāng)細(xì)胞完全融合后，將培養(yǎng)基換為分化培養(yǎng)基（即DMEM 培養(yǎng)基中含5 μg/mL 胰島素，0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，1 μmol/L 地塞米松，1 μmol/L羅格列酮和10%胎牛血清）。2 d 后，換為維持培養(yǎng)基（即DMEM 培養(yǎng)基中含5 μg/mL 胰島素和10%胎牛血清），每2 d 更換1 次培養(yǎng)基，共誘導(dǎo)分化8 d 后，在顯微鏡下觀察，細(xì)胞周圍已形成明顯脂滴，即已將前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞[8]。

1.3 柚皮苷處理 前體脂肪細(xì)胞（未分化）和成熟脂肪細(xì)胞（分化細(xì)胞）均培養(yǎng)在DMEM 高糖培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清），并分別在其培養(yǎng)基中加入不同濃度（0、50、200、600 μmol/L）柚皮苷，0 μmol/L 為對(duì)照組，處理24 h 后用于試驗(yàn)檢測(cè)，每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

1.4 Hoechst 染色 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，用固定液固定脂肪細(xì)胞10 min，去掉固定液后用PBS 清洗2 次。加入Hoechst 33258 染色液，染色5 min，去掉染色液后用PBS 清洗2 次后即置于熒光顯微鏡下觀察拍照，激發(fā)波長(zhǎng)為350 nm。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)脂肪細(xì)胞凋亡率 收集脂肪細(xì)胞后，加入500 μL Binding Buffer 緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin-V、5 μL PI 混勻，避光孵育10 min 后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 熒光定量PCR 檢測(cè)凋亡因子mRNA 表達(dá) RNA 的提取參照試劑盒說(shuō)明書，提取的RNA 經(jīng)過(guò)濃度和純度檢測(cè)后，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)GenBank 中的基因序列設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成（表1），GAPDH為管家基因。按照TaKaRa 熒光定量PCR 試劑盒（SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ）和Real-Time PCR System 的使用說(shuō)明進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系20 μL：SYBR qPCR Mix 10 μL，cDNA 4 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，ROX reference Dye Ⅱ 0.4 μL，ddH2O 4 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火34 s，共40 個(gè)循環(huán)。采用2-△△CT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。應(yīng)用SPSS17.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），P<0.05 表示差異顯著。

1.7 Western blotting 測(cè)定凋亡因子蛋白表達(dá) 使用RIPA 裂解液提取總蛋白。用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，以5×SDS 上樣緩沖液與蛋白樣品1:4 比例混合，金屬浴100℃中5 min 使蛋白完全變性，上樣。12%的SDS-PAGE 膠進(jìn)行蛋白分離，然后轉(zhuǎn)印到0.22 μm PVDF 膜上，5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h 后加封閉液配置的一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜5 次后，加入封閉液配置的二抗室溫孵育1 h 后洗膜3 次。最后用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒和自動(dòng)發(fā)光曝光儀進(jìn)行顯色拍照分析。

2 結(jié)果

2.1 柚皮苷對(duì)脂肪細(xì)胞凋亡的影響 由圖1 所示，柚皮苷處理未導(dǎo)致前體脂肪細(xì)胞凋亡。在成熟脂肪細(xì)胞中，柚皮苷處理導(dǎo)致細(xì)胞呈致密濃染，細(xì)胞核顏色呈亮白色增多，表明柚皮苷引起了成熟脂肪細(xì)胞凋亡；與200、600 μmol/L 柚皮苷組相比，50 μmol/L 柚皮苷組的細(xì)胞凋亡特征更明顯。

表1 熒光定量PCR 引物序列

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的結(jié)果與hoechst 染色結(jié)果基本一致。柚皮苷處理幾乎未引起前體脂肪細(xì)胞凋亡率升高。在成熟脂肪細(xì)胞中，添加不同濃度柚皮苷均上調(diào)了細(xì)胞凋亡率，且50 μmol/L 柚皮苷處理導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡率更高（圖2）。從脂肪細(xì)胞形態(tài)和脂肪細(xì)胞凋亡率兩方面看，柚皮苷處理導(dǎo)致了成熟脂肪細(xì)胞誘凋亡，而未引起前體脂肪細(xì)胞凋亡。

2.2 柚皮苷對(duì)脂肪細(xì)胞凋亡因子mRNA 表達(dá)的影響 熒光定量PCR 結(jié)果表明（圖3），柚皮苷對(duì)前體脂肪細(xì)胞中凋亡基因的表達(dá)無(wú)顯著影響。與對(duì)照組相比，50 μmol/L 柚皮苷顯著上調(diào)了成熟脂肪細(xì)胞中促凋亡因子Bax、Bcl-2、PARP和APAF-1的mRNA 表達(dá)量。200、600 μmol/L 柚皮苷處理對(duì)上述促凋亡因子的mRNA 表達(dá)無(wú)顯著影響。

2.3 柚皮苷對(duì)脂肪細(xì)胞凋亡因子蛋白表達(dá)的影響 由圖4 可見，柚皮苷處理幾乎未導(dǎo)致前體脂肪細(xì)胞中促凋亡蛋白表達(dá)的變化，僅600 μmol/L 柚皮苷處理對(duì)Bax 和APAF-1 的蛋白表達(dá)水平有一定程度的上調(diào)。在成熟脂肪細(xì)胞中，添加不同濃度柚皮苷均不同程度地上調(diào)了Bax 和APAF-1 的表達(dá)，且50 μmol/L 柚皮苷處理的作用最強(qiáng)。

圖1 柚皮苷對(duì)脂肪細(xì)胞凋亡的影響

圖2 柚皮苷對(duì)脂肪細(xì)胞凋亡率的影響

圖3 柚皮苷對(duì)脂肪細(xì)胞凋亡因子mRNA 表達(dá)的影響

圖4 柚皮苷對(duì)脂肪細(xì)胞凋亡因子蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

柚皮苷作為一種新型飼料添加劑，能減少動(dòng)物脂肪沉積，抑制3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞增殖分化[9]，但目前柚皮苷與脂肪細(xì)胞凋亡之間的調(diào)控關(guān)系還不明確?，F(xiàn)有研究表明，與柚皮苷類似的一些天然活性物質(zhì)能促進(jìn)脂肪細(xì)胞凋亡。Singh 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，千層紙素A 抑制了3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞增殖，可能與誘導(dǎo)了前體脂肪細(xì)胞凋亡有關(guān)；千層紙素A 還減少了成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)積累，并通過(guò)刺激促凋亡蛋白Bax、細(xì)胞色素C（CYTC）和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，染料木黃酮也能促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞凋亡[11-12]。千層紙素A 和染料木黃酮都屬于黃酮類物質(zhì)，本試驗(yàn)中柚皮苷也是一種黃酮類物質(zhì)，但柚皮苷僅誘導(dǎo)了成熟脂肪細(xì)胞凋亡并促進(jìn)了相關(guān)促凋亡因子的表達(dá)，而未引起前體脂肪細(xì)胞凋亡；表明即使同屬黃酮類物質(zhì)，但由于分子結(jié)構(gòu)等不同，使得它們對(duì)脂肪細(xì)胞凋亡的影響也不完全一致。Lin 等[13]也發(fā)現(xiàn)兒茶素能增加成熟脂肪細(xì)胞凋亡，而不影響前體脂肪細(xì)胞的生存能力，說(shuō)明同一物質(zhì)對(duì)不同分化狀態(tài)的脂肪細(xì)胞具有差異的調(diào)控作用。此外，Guo 等[7]研究發(fā)現(xiàn)柚皮苷可顯著抑制3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞增殖，但其并未就柚皮苷是否通過(guò)誘導(dǎo)前體脂肪細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖進(jìn)行深入研究，而本試驗(yàn)結(jié)果表明柚皮苷處理未導(dǎo)致3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞凋亡，提示柚皮苷對(duì)3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞增殖的抑制作用不是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

黃酮類天然活性物質(zhì)作用于細(xì)胞凋亡過(guò)程中的多個(gè)基因和信號(hào)通路。柚皮素通過(guò)降低抗凋亡蛋白蘇氨酸激酶（p-Akt）的表達(dá)以及增加促凋亡蛋白Bax 表達(dá)，從而促進(jìn)人脂肪前細(xì)胞系A(chǔ)ML-I 細(xì)胞凋亡[14]。另有試驗(yàn)證明，人參皂苷Rh2 通過(guò)Akt/Bax/caspase9 途徑誘導(dǎo)急性早幼粒白血病細(xì)胞系NB4 細(xì)胞凋亡[15]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，柚皮苷上調(diào)了Bax mRNA 和蛋白表達(dá)水平，提示柚皮苷可能通過(guò)Akt/Bax 途徑誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞凋亡。此外，納曲酮能激活Bax/Bcl-2/caspase-3/PARP 信號(hào)通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡[16]。Kwak 等[17]研究表明，甘草查耳酮通過(guò)影響促凋亡因子Bax、Bcl-2、CYTC、APAF-1 和PARP 等的蛋白水平，進(jìn)而誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞凋亡。雖然與上述研究中的細(xì)胞類型有差異，但本研究中柚皮苷通過(guò)提高Bax、Bcl-2、APAF-1和PARP的表達(dá)水平誘導(dǎo)成熟脂肪細(xì)胞凋亡的試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果類似。研究還發(fā)現(xiàn)，黃酮類物質(zhì)的抗脂肪沉積作用與AMPK通路和Wnt 通路活化誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞凋亡有關(guān)[18-20]，但柚皮苷對(duì)上述信號(hào)通路的調(diào)控作用尚需進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，50、200、600 μmol/L 柚皮苷處理未導(dǎo)致3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞凋亡；50 μmol/L 柚皮苷能通過(guò)上調(diào)促凋亡因子Bax、Bcl-2、PARP和APAF-1的mRNA 表達(dá)以及Bax 和APAF-1 的蛋白表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)3T3-L1 成熟脂肪細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減少動(dòng)物脂肪沉積。