蔡靜靜，張亞川，李 谞，張 艷，倪永清

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

乳酸菌是指一類(lèi)可以利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌，乳酸菌被應(yīng)用于人類(lèi)生活的方方面面，如改善食品風(fēng)味、延長(zhǎng)食品儲(chǔ)藏期、促進(jìn)人體健康。

酸乳是乳酸菌在代謝過(guò)程中發(fā)生酸化作用得到的一款產(chǎn)品，乳酸菌會(huì)對(duì)牛乳的理化、感官和微生物組成產(chǎn)生重大影響[1]。發(fā)酵乳生產(chǎn)過(guò)程中使用的乳酸菌主要包括發(fā)酵劑乳酸菌、非發(fā)酵劑乳酸菌以及益生乳酸菌。發(fā)酵劑乳酸菌是一類(lèi)能夠在乳制品中生長(zhǎng)并能產(chǎn)酸凝乳的乳酸菌[2]，通常通過(guò)評(píng)估乳酸菌的產(chǎn)酸速率、產(chǎn)香特性以及改善酸乳質(zhì)構(gòu)的能力篩選發(fā)酵劑乳酸菌[3]。傳統(tǒng)酸乳通常以保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌作為發(fā)酵劑[4]，盡管一些保加利亞乳桿菌具有耐受消化道胃腸液的能力，但是與大多數(shù)人用益生菌相比，保加利亞乳桿菌不具有宿主同源性，因此，在酸乳生產(chǎn)中經(jīng)常會(huì)添加一些常用的益生菌提高酸乳的保健價(jià)值[5]。益生菌被定義為具有活性的、當(dāng)達(dá)到一定施用量時(shí)會(huì)對(duì)宿主產(chǎn)生有益作用的微生物[6]。益生菌應(yīng)具有非致病性和非產(chǎn)毒性、抑制病原菌生長(zhǎng)、耐受胃腸道環(huán)境等特性[7-9]，并且還應(yīng)具有一定的黏附性[10-11]。乳酸菌通常被認(rèn)為是安全（generally regarded as safe，GRAS）的益生菌，廣泛應(yīng)用于食品和藥品的生產(chǎn)中[12]。

新疆是少數(shù)民族聚居區(qū)之一，少數(shù)民族同胞獨(dú)特的文化習(xí)俗以及生活習(xí)慣，為優(yōu)良發(fā)酵劑乳酸菌以及益生型乳酸菌的開(kāi)發(fā)提供了豐富的資源。本研究旨在通過(guò)對(duì)新疆伊犁地區(qū)傳統(tǒng)乳制品中分離出乳酸菌的發(fā)酵和益生特性進(jìn)行研究，為開(kāi)發(fā)出一款益生型酸奶提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：XKN1-5為L(zhǎng)euconostoc lactis；BSTS6-1、BSTS6-3、BSTS6-4為L(zhǎng)actobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus；BST2-3為L(zhǎng)actobacillus fermentum；XSXN1-1、XSXN1-2為Streptococcus thermophilus。均為實(shí)驗(yàn)室前期從新疆伊犁地區(qū)傳統(tǒng)乳制品中分離得到。

病原指示菌：出血性大腸埃希氏菌（CICC 21530）、致瀉大腸埃希氏菌（CICC 10411）、鼠傷寒沙門(mén)氏菌（CICC 10420）、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌（CICC 10421）、單核細(xì)胞性李斯特菌（CGMCC 1.9136）、血清型腸炎沙門(mén)氏菌（CGMCC 1.10754）、金黃色葡萄球（CICC 21600），購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保存管理中心。

全脂乳粉（蛋白質(zhì)38%、脂肪53%） 新疆石河子花園乳業(yè)有限公司；丁二酮 北京索萊寶生物科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TA.XTPlus質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)SMS公司；RVDV-III流變儀 美國(guó)Strider Tech公司；UV1240外分光光度計(jì) 中國(guó)睿誠(chéng)永創(chuàng)公司；5417R高速冷凍離心機(jī)德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌發(fā)酵性能分析

1.3.1.1 乳酸菌酸化能力

將單菌株發(fā)酵劑以2%的接種量接種于復(fù)原乳中，記錄凝乳時(shí)間，并將樣品置于4 ℃保藏備用，取5.0 g冷藏24 h的酸乳樣品并加入5 滴0.5%酚酞指示劑，用0.1 mol/L標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定至粉紅色，1 min不消失為宜。記錄NaOH消耗量及酸乳質(zhì)量[13]。計(jì)算如式（1）所示：

式中：X1為試樣的酸度/（°T）；C1為NaOH濃度/（mol/L）；V1為樣品消耗NaOH溶液體積/mL；V0為空白消耗NaOH溶液體積/mL；100為100 g試樣；M1為試樣的質(zhì)量/g；0.01為酸度理論定義NaOH濃度/（mol/L）。

1.3.1.2 酸乳感官評(píng)價(jià)

組織食品專(zhuān)業(yè)的20 名研究生，對(duì)酸乳樣品的色澤、風(fēng)味、組織狀態(tài)進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。感官評(píng)價(jià)細(xì)則參考熊政委等[14]，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 感官評(píng)分細(xì)則Table 1 Criteria for sensory evaluation

1.3.1.3 乳酸菌對(duì)酸乳質(zhì)構(gòu)特性的影響

全質(zhì)構(gòu)分析：利用物性測(cè)試儀，P/36 R探頭。測(cè)試前速率：5.00 mm/s；測(cè)試速率：1.00 mm/s；測(cè)試后速率：5.00 mm/s；測(cè)試距離：30 mm；感應(yīng)力：Auto(Force)-2 g。由質(zhì)構(gòu)特性曲線(xiàn)圖得出表征質(zhì)構(gòu)狀況的評(píng)價(jià)參數(shù)硬度、黏附性、彈性、內(nèi)聚性和膠黏性[15]。

表觀(guān)黏度測(cè)定：由DHR流變儀在flow peak模式下，剪切速率為10 s-1，在25 ℃條件下測(cè)定[16]。

保水性測(cè)定：稱(chēng)取15 g酸乳樣品于50 mL離心管中，10 000×g離心20 min，酸乳的保水率用離心后剩余沉淀質(zhì)量與樣品質(zhì)量比值表示[17]。

1.3.1.4 乳酸菌產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)能力分析

參考萬(wàn)金敏[18]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1）雙乙酰含量測(cè)定

丁二酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：取15 μL丁二酮溶于蒸餾水中，定容至500 mL。分別量取丁二酮標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL于編號(hào)的12 支雙排放置試管中，并用蒸餾水補(bǔ)足至10 mL。向前排6 支試管中加1%的鄰苯二胺溶液0.5 mL，后排6 支試管不加鄰苯二胺溶液，充分混勻后于黑暗處反應(yīng)30 min。反應(yīng)完全后加4.0 mol/L鹽酸進(jìn)行終止反應(yīng)（前排試管加2.0 mL，后排試管加 2.5 mL，搖勻后以后排試管為空白對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)在335 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以丁二酮濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程y=0.116 2x＋0.040 7，R2=0.999 9，計(jì)算雙乙酰含量。

丁二酮含量的測(cè)定：取待測(cè)酸乳樣品，用16%三氯乙酸溶液等體積與其混合，混勻后靜置10 min，3 500×g離心10 min。取上清液20 mL，等體積加入2 個(gè)試管中，向1號(hào)試管中加入1%的鄰苯二胺溶液0.5 mL，2 號(hào)試管不加，充分混勻后于黑暗處使其反應(yīng)30 min，然后向2 個(gè)試管中加入4.0 mol/L的鹽酸終止反應(yīng)（1號(hào)試管加2.0 mL，2號(hào)試管加2.5 mL），混勻后以2號(hào)試管作為對(duì)照液，在335 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。如果樣品中丁二酮含量較高，測(cè)得的吸光度超過(guò)0.2～1.0范圍，可用8%三氯乙酸對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂屘幚怼?/p>

2）乙醛含量測(cè)定

試劑配制：稱(chēng)取12.70 g碘于500 mL燒杯中，加入40 g碘化鉀，加適量的水溶解，移至1 000 mL棕色容量瓶，定容搖勻，配制成0.1 mol/L碘標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后準(zhǔn)確量取10.00 mL的0.1 mol/L碘標(biāo)準(zhǔn)溶液于100 mL棕色容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻，兩種溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

樣品測(cè)定：取1% NaHSO3溶液5 mL置于250 mL錐形瓶中，加入處理后試樣上清液25 mL，混勻后在室溫下放置1 h，然后加入1%淀粉溶液1 mL，用0.1 mol/L碘液滴定至接近淡藍(lán)紫色，再用0.01 mol/L碘液滴定至淡藍(lán)紫色，并且在30 s內(nèi)淡藍(lán)紫色不褪去，以上滴定均不計(jì)數(shù)。然后加入20 mL 1 mol/L的NaHCO3溶液，充分振蕩混勻，使溶液藍(lán)紫色消失，最后用0.01 mol/L碘液滴定至藍(lán)紫色終點(diǎn)，記錄消耗標(biāo)準(zhǔn)碘液的體積，每個(gè)樣品有2 個(gè)平行，并同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

式中：M為乙醛質(zhì)量濃度/（mg/L）；V1為滴定樣品消耗碘標(biāo)準(zhǔn)溶液體積/mL；V2為滴定空白消耗碘標(biāo)準(zhǔn)溶液體積/mL；C為碘標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度/（mol/L）；25為樣品稱(chēng)樣量/mL；0.022為乙醛反應(yīng)化學(xué)基本單位/g。

1.3.2 乳酸菌益生特性分析

1.3.2.1 抑菌特性

用培養(yǎng)18 h的病原指示菌（濃度為107CFU/mL）100 μL，牛津杯法測(cè)定菌株抑菌能力。取37 ℃培養(yǎng)36 h的菌株菌懸液，10 000×g離心10 min后用1 mol/L NaOH溶液將pH值調(diào)至6.0，并用過(guò)氧化氫酶和胰蛋白酶處理上清液，然后用22 μm濾膜過(guò)濾，滅菌后取200 μL加入牛津杯中，將平板置于4 ℃靜置5 h，直至上清液擴(kuò)散到瓊脂中。37 ℃培養(yǎng)24 h后，使用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑[19]。

1.3.2.2 菌株黏附性

參考趙圣明等[20]的方法測(cè)定菌株的疏水性和自凝集性。

疏水性：將菌株發(fā)酵液4 000×g離心20 min，用生理鹽水洗滌2 次后重懸于0.1 mol/L KNO3（pH 6.2）溶液中，調(diào)節(jié)菌懸液濃度為107CFU/mL，600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸光度（A0）；分別吸取1 mL二甲苯、乙酸乙酯、氯仿溶劑加到3 mL菌液中混勻，室溫放置10 min后渦旋振蕩2 min，室溫靜置20 min后取水相，測(cè)定其在600 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A1）。細(xì)菌疏水率用式（3）計(jì)算：

自凝集能力：將菌株發(fā)酵液4 000×g離心20 min，用磷酸鹽緩沖液洗滌2 次后調(diào)節(jié)菌懸液濃度為107CFU/mL。取5 mL菌懸液于10 mL試管中漩渦振蕩10 s，在室溫條件下靜置5 h，每隔1 h取出菌懸液置于600 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度。每組3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。菌株自凝集率用式（4）計(jì)算：

式中：At為菌懸液在1、2、3、4 h和5 h不同時(shí)間的吸光度；A0為第0小時(shí)的吸光度。

1.3.2.3 耐受胃腸液能力

胃蛋白酶溶解于無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L，pH 3.0）中制備成終質(zhì)量濃度為3 g/L的模擬胃液[21]。胰蛋白酶溶解于含有0.3%牛膽鹽的無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液中（0.2 mol/L，pH 8.0）中制成胰蛋白酶終質(zhì)量濃度為1 g/L的模擬腸液[22]。

將菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，4 ℃、4 000×g離心10 min收集菌體，用無(wú)菌生理鹽水洗滌3 次后重懸于模擬胃液中，調(diào)節(jié)菌懸液濃度為109CFU/mL。將菌株置于37 ℃條件下培養(yǎng)，分別于0、1、2、3 h后取出進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。將1 mL胃液處理3 h后的菌株離心后重懸至模擬腸液中，置于37 ℃條件下培養(yǎng)，分別于2、4、6 h后取出進(jìn)行平板計(jì)數(shù)[23]。

1.3.2.4 菌株耐藥性

采用紙片擴(kuò)散法（K-B法）對(duì)菌株進(jìn)行20 種抗生素藥敏實(shí)驗(yàn)。取100 μL濃度為107～108CFU/mL的菌懸液，使用滅菌棉簽將其均勻涂布于MRS平板，待其表面干燥后將藥片貼上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀(guān)察抑菌結(jié)果，檢測(cè)抑菌圈直徑，每種抗生素藥片做3 個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果參照CLSI 2012抗微生物藥物敏感性實(shí)驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.3 復(fù)合發(fā)酵菌種復(fù)配

依照益生實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將7 株乳酸菌按酸化能力、產(chǎn)香性能、改善質(zhì)構(gòu)性能、益生性能進(jìn)行分組，每4 株菌組合進(jìn)行復(fù)配發(fā)酵，并通過(guò)分析對(duì)比，選出最優(yōu)的菌株組合方式。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果以±s表示，顯著性分析使用Duncan檢驗(yàn)（P＜0.05，差異顯著）；使用Origin 9.1軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株發(fā)酵特性分析

2.1.1 酸化能力

表2 乳酸菌發(fā)酵性能初篩Table 2 Fermentation performance of LAB strains

酸化能力較強(qiáng)的菌株會(huì)導(dǎo)致酸乳過(guò)度酸化失去食用價(jià)值，酸化能力較弱會(huì)影響酸乳中風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生，也易使酸乳感染雜菌。研究表明，消費(fèi)者能夠接受酸乳酸度為70～110 °T[24]。由表2可以看出，大部分株菌的酸度在70～90 °T，產(chǎn)酸能力適中，滿(mǎn)足生產(chǎn)需求。在酸乳生產(chǎn)過(guò)程中，如果凝乳時(shí)間太短，不利于酸乳香味的生成，也會(huì)對(duì)酸乳的組織狀態(tài)產(chǎn)生影響；凝乳時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，雖然對(duì)狀態(tài)和香味有一定作用，但不利于節(jié)約生產(chǎn)能源和時(shí)間，也易造成發(fā)酵過(guò)程中的雜菌污染[25]。由表2可以看出，菌株的凝乳時(shí)間均不大于14 h，其中菌株BSTS6-4和菌株XKN1-5凝乳時(shí)間較快，8 h左右即可凝乳，凝乳時(shí)間較其他菌株短。

2.1.2 感官評(píng)價(jià)

由7 株乳酸菌發(fā)酵制成的酸乳的感官評(píng)分見(jiàn)表2。7 株菌發(fā)酵所得酸乳色澤較為良好，均呈現(xiàn)乳白色或微黃色；除菌株BST2-3因產(chǎn)酸不足導(dǎo)致的酸乳風(fēng)味不佳外，其余菌株均具有酸乳特有的風(fēng)味且無(wú)苦澀味；菌株BSTS6-1、BSTS6-3、BSTS6-4、XSXN1-1、XSXN1-2發(fā)酵制得的酸乳質(zhì)地細(xì)膩、表面光滑和無(wú)裂縫，菌株BST2-3發(fā)酵制得的酸乳有輕微的分層現(xiàn)象，可能與其酸化能力弱，凝乳不充分的原因有關(guān)，XKN1-5發(fā)酵制得的酸乳有輕微的乳清析出。

2.1.3 單菌株發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)特性分析

通過(guò)比較各個(gè)酸乳樣品的硬度、黏附性、彈性、內(nèi)聚性、膠黏性、保水率以及表觀(guān)黏度評(píng)估發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)特性，量化比較各項(xiàng)物性指標(biāo)的差異性。由表3可以看出，各菌株酸乳在質(zhì)構(gòu)特性上存在差異（P＜0.05），其中硬度、黏附性、保水率、表觀(guān)黏度受發(fā)酵菌株的影響較大。菌株BSTS6-3、XSXN1-2發(fā)酵制得的酸乳大部分物性指標(biāo)較其他幾株菌好，其中菌株BSTS6-3的表觀(guān)黏度達(dá)到了3.50 Pa·s，保水率達(dá)55.23%；菌株XSXN1-2的表觀(guān)黏度達(dá)到了3.80 Pa·s，保水率達(dá)58.51%。劉娜等[26]對(duì)酸羊奶、酸牛奶分離出的保加利亞乳桿菌MAU40167進(jìn)行研究，結(jié)果顯示其保水率達(dá)58.24%，黏度為0.96 Pa·s。Wang Jicheng等[27]研究表明L.caseiZhang發(fā)酵所得酸乳的保水率為60%，表觀(guān)黏度為3.96 Pa·s。說(shuō)明菌株具有商業(yè)應(yīng)用潛力。

表3 單菌株發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)特性Table 3Texture characteristics of milk fermented by single-strain cultures

2.1.4 菌株產(chǎn)香特性分析

乙醛和雙乙酰是構(gòu)成酸乳典型風(fēng)味的重要化合物，其含量以及兩者之間比例會(huì)對(duì)酸乳風(fēng)味產(chǎn)生較大的影響[28]，由圖1可以看出，大部分菌株乙醛質(zhì)量濃度大于10 mg/L，乙醛是酸乳主要的風(fēng)味物質(zhì)，其含量對(duì)酸乳風(fēng)味的影響較大，要使酸奶達(dá)到良好的風(fēng)味，乙醛質(zhì)量濃度應(yīng)該在10～15 μg/mL之間[29]；有研究表明乙醛與雙乙酰含量比值大于3∶1時(shí)，酸乳的風(fēng)味最佳[30]。由圖1可知，各組發(fā)酵乳乙醛和雙乙酰含量之比均大于3∶1，尤其菌株BSTS6-1、XSXN1-1雙乙酰及乙醛產(chǎn)量均較其他菌株高，產(chǎn)香能力突出，其中菌株XSXN1-1的乙醛質(zhì)量濃度可達(dá)16 mg/L，雙乙酰質(zhì)量濃度達(dá)到2.02 mg/L。

圖1 單菌株產(chǎn)香性能Fig.1 Aroma-producing ability of single-strain cultures

2.2 菌株益生特性分析

2.2.1 菌株抑制腸道病原菌特性

由表4可以看出，7 株乳酸菌都對(duì)大腸埃希氏菌均具有較好的抑制性，其中桿菌抑菌效果明顯優(yōu)于球菌。有研究表明，引起細(xì)菌性腹瀉的致病菌主要為大腸埃希氏菌，郭利敏等[31]收集分析了463 名腹瀉患者的糞便樣品，得出引起腹瀉的主要原因?yàn)橹聻a大腸埃希氏菌感染；李迎慧等[32]對(duì)深圳市腹瀉人群進(jìn)行調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致該地區(qū)人群腹瀉的主要致病菌為致瀉大腸埃希氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌。本研究菌株BSTS6-4、BSTS6-3、BSTS6-1、BST2-3的發(fā)酵上清液對(duì)7 種常見(jiàn)腸道致病菌均有不同程度的抑制作用，抑菌譜較廣，可能是菌株在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有機(jī)酸、過(guò)氧化氫及細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)，能有效地抑制這些腸道致病菌的生長(zhǎng)，從而使得這些乳酸菌在開(kāi)發(fā)治療腹瀉的藥物中具有應(yīng)用的潛力[33]。

表4 不同菌株抑菌特性Table 4 Antibacterial properties of seven different strains

2.2.2 模擬胃腸液耐受性

益生菌需經(jīng)過(guò)胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)才能到達(dá)腸道發(fā)揮益生作用，因此，益生菌菌株必須克服苛刻的消化道環(huán)境，例如胃酸以及腸道中的膽汁和消化酶[34]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外模擬胃腸道環(huán)境對(duì)7 株乳酸菌的胃腸液耐受性進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表5?？梢钥闯? 株乳酸菌均可以耐受模擬胃液，只是在耐受程度上有差異（P＜0.05），其中菌株BSTS6-1、XKN1-5、BST2-3、XSXN1-1在3 h的模擬胃液處理后的存活率高達(dá)89%以上；模擬腸液實(shí)驗(yàn)中，7 株乳酸菌對(duì)胃液也表現(xiàn)出不同程度的耐受性（P＜0.05），其中菌株BSTS6-1、BSTS6-3、BSTS6-4耐受腸液能力較差，在模擬腸液中連續(xù)處理6 h后存活率均較低。菌株BST2-3耐受腸液能力最佳，6 h模擬腸液處理后存活率仍達(dá)77.1%，活菌數(shù)高于106CFU/mL，符合乳酸菌應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中的最低要求。

表5 不同菌株在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中的耐受性Table 5 Gastrointestinal transit tolerance of seven different strains

2.2.3 黏附性

圖2 不同菌株疏水性Fig.2 Hydrophobicity of different strains

細(xì)菌表面疏水性和自聚集能力作為乳酸菌的表面特性，被用于間接評(píng)估益生菌的黏附能力[35]。菌體表面疏水性是影響乳酸菌黏附性典型的內(nèi)在因素，近年來(lái)普遍地作為評(píng)價(jià)乳酸菌黏附性能的重要參數(shù)[36]。由圖2可以看出，所有菌株均表現(xiàn)出一定的疏水性，不同菌株的疏水性存在差異（P＜0.05）。乙酸乙酯是單堿性溶劑，屬于電子供體，氯仿是酸性溶劑，屬于電子受體，供試的7 株乳酸菌對(duì)氯仿的疏水性都明顯的高于對(duì)乙酸乙酯的疏水性，說(shuō)明這幾株菌都是電子供體；二甲苯為非極性溶劑，7 株乳酸菌均表現(xiàn)出對(duì)二甲苯的黏附性（＞50%），表明這些菌株的細(xì)胞表面都具有疏水性。

菌株的自凝集是指同一種菌株間相互凝集形成多細(xì)胞簇的現(xiàn)象，有研究證明細(xì)胞表面疏水性和自聚集的體外實(shí)驗(yàn)可用于初步篩選適合商業(yè)應(yīng)用的潛在黏附細(xì)菌[37]。由表6可以看出，在5 h的靜置過(guò)程中，7 株乳酸菌的自凝集率隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增大，其中菌株BSTS6-4、BSTS6-1、BST2-3的自凝集能力較強(qiáng)，自凝集率可達(dá)50%以上，具有較好的自凝集能力，進(jìn)一步證明這些菌株可以黏附于胃腸道，發(fā)揮其益生特性，有作為益生菌應(yīng)用于食品工業(yè)的潛力。

表6 不同菌株自凝集率Table 6Self-aggregation characteristics of seven different strains%

2.2.4 菌株耐藥性分析

腸道微生物可以通過(guò)自發(fā)突變或通過(guò)腸道或結(jié)腸內(nèi)的其他物種的水平轉(zhuǎn)移獲得抗性基因，產(chǎn)生抗生素抗性[38]。盡管乳酸菌被認(rèn)為是安全的菌株，但是對(duì)于所選定的菌株還是要通過(guò)評(píng)估其傳播和接受抗生素基因的能力評(píng)估其安全性。

圖3 基于抑菌圈直徑對(duì)7 株乳酸菌的抗生素抗性熱圖分析Fig.3 Heatmap of antibiotic resistance of 7 strains of LAB based on diameter of inhibition zone

熱圖可以通過(guò)顏色梯度表示7 株乳酸菌抗生素抑菌圈的大小，進(jìn)而直觀(guān)顯示出7 株乳酸菌的抗生素耐藥性，顏色有紅色漸變?yōu)榉奂t色、白色、綠色，代表抑菌圈直徑的不斷縮小。由圖3可以看出，綠色區(qū)域主要集中在環(huán)丙沙星、諾氟沙星、卡那霉素、多黏霉素、阿米卡星這5 種抗生素中，表示大多數(shù)菌株對(duì)這5 種抗生素表現(xiàn)出耐藥性，有研究報(bào)道乳酸菌對(duì)大多數(shù)核酸抑制劑耐藥，其耐藥機(jī)制主要受乳酸菌存在的藥物外排系統(tǒng)、甲基轉(zhuǎn)移酶以及產(chǎn)生的藥物滅活酶所介導(dǎo)[39]。本研究中卡那霉素、多黏霉素、阿米卡星均屬于氨基糖苷類(lèi)抗生素，表明本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與之前報(bào)道較一致。圖中大部分區(qū)域的顏色位于紅色和綠色的漸變區(qū)域，表明7 株乳酸菌對(duì)大部分抗生素敏感。從熱圖縱向分析，大部分菌株對(duì)于頭孢噻肟、四環(huán)素、米諾環(huán)素、利福平、氯霉素、紅霉素、羥氨芐青霉素、青霉素、氨芐西林、克林霉素、鏈霉素、萬(wàn)古霉素、苯唑西林、慶大霉素表現(xiàn)出敏感；從橫向分析，菌株BST2-3所對(duì)應(yīng)區(qū)域顏色介于紅色與綠色之間的漸變區(qū)域，表明對(duì)20 種實(shí)驗(yàn)用抗生素藥片均表現(xiàn)出敏感，即菌株安全性較高，這可能與樣品的采集地有關(guān)，新疆伊犁自治州是我國(guó)主要的畜牧業(yè)基地之一，該地區(qū)的少數(shù)民族經(jīng)常手工制作各種發(fā)酵乳制品，極少使用抗生素，因此有很多天然益生菌資源值得開(kāi)發(fā)。

2.3 最優(yōu)組合菌株篩選

2.3.1 菌株組合方式

單菌株的發(fā)酵和益生實(shí)驗(yàn)研究中，酸化能力較優(yōu)的菌株為XKN1-5和BSTS6-4，能顯著改善酸乳質(zhì)構(gòu)的菌株為BSTS6-3和XSXN1-2，產(chǎn)香能力較為突出的菌株為BSTS6-1和XSXN1-1，益生特性較為突出的菌株為BST2-3，依照酸化、產(chǎn)香、質(zhì)構(gòu)以及益生實(shí)驗(yàn)結(jié)果將7 株乳酸菌分為4 組進(jìn)行組合復(fù)配，共得到8 種組合，如表7所示。按照1∶1∶1∶1的菌種接種比例進(jìn)行發(fā)酵，選擇其中最優(yōu)的復(fù)合發(fā)酵菌株的組合方案。

表7 復(fù)合發(fā)酵菌株組合方案Table 7Combinations of seven strains for mixed-culture fermentation

2.3.2 菌株組合方式對(duì)酸奶品質(zhì)的影響

不同菌株組合方式對(duì)酸乳總酸度、風(fēng)味物質(zhì)、凝乳時(shí)間以及感官評(píng)價(jià)等的影響見(jiàn)表8。8 組樣品的酸度均控制在70～110 °T，符合國(guó)家規(guī)定的酸乳酸度要求；8 組樣品的風(fēng)味物質(zhì)含量均處于較高水平，其中以5號(hào)組合最為突出，發(fā)酵乳中雙乙酰質(zhì)量濃度達(dá)7.96 mg/L，乙醛質(zhì)量濃度達(dá)28.68 mg/L；8 組樣品的凝乳時(shí)間均控制在5.5 h左右，凝乳時(shí)間較短，節(jié)省成本；8 組酸乳樣品的感官評(píng)分均較單菌株發(fā)酵酸乳高，表明復(fù)合發(fā)酵在一定程度上提升了酸乳的品質(zhì)，其中5號(hào)組合復(fù)合發(fā)酵制得的酸乳樣品組織細(xì)膩、口感順滑、酸甜適中且具有酸牛乳獨(dú)有的風(fēng)味，受到大多數(shù)評(píng)測(cè)者的喜愛(ài)，感官評(píng)分顯著高于其他幾組（P＜0.05）。

表8 菌株組合方式對(duì)酸奶發(fā)酵性能的影響Table 8 Effects of different strain combinations on acidity, sensory score and coagulation time of yoghurt

表9 菌種組合方式對(duì)發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)特性的影響Table 9 Texture characteristics of fermented milk with different strain combinations

如表9所示，復(fù)合發(fā)酵制得酸乳的各項(xiàng)質(zhì)構(gòu)指標(biāo)均較單菌株發(fā)酵好，其中5號(hào)組合黏附性、膠黏性、保水率以及表觀(guān)黏度均較其他幾組好，表現(xiàn)出良好的質(zhì)構(gòu)特性。綜上所述，5號(hào)組合方式為復(fù)合發(fā)酵菌株的最佳方案，其菌種組成為L(zhǎng).delbrueckiisubsp.bulgaricus（BSTS6-4和BSTS6-3）、L.lactisXSXN1-1以及L.fermentumBST2-3。使用該混合菌種組合發(fā)酵酸乳，發(fā)酵時(shí)間短，發(fā)酵制得酸乳組織狀態(tài)良好，風(fēng)味獨(dú)特，而且還具有一定的益生特性。

3 結(jié) 論

通過(guò)發(fā)酵和益生實(shí)驗(yàn)對(duì)從新疆伊犁地區(qū)乳品中分離的7 株優(yōu)良乳酸菌進(jìn)行分析研究，以獲得最優(yōu)的復(fù)合發(fā)酵菌株的組合方案。單菌株發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中XKN1-5和BSTS6-4酸化能力較強(qiáng)，BSTS6-3和XSXN1-2發(fā)酵所制得的酸奶質(zhì)構(gòu)特性較佳，BSTS6-1和XSXN1-1產(chǎn)香能力突出；益生實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明菌株BST2-3在模擬胃腸液處理9 h后活菌數(shù)仍可達(dá)106CFU/mL，滿(mǎn)足了益生菌到達(dá)胃腸道所需的最低活菌數(shù)要求；同時(shí)7 株乳酸菌對(duì)大部分所試抗生素表現(xiàn)敏感，安全性較好。根據(jù)發(fā)酵和益生實(shí)驗(yàn)結(jié)果將菌株分為4 組，每4 株菌組合進(jìn)行酸乳發(fā)酵，共得到8 種組合方式。將8 組復(fù)合發(fā)酵所得酸乳的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行分析對(duì)比，結(jié)果顯示，5號(hào)組合凝乳時(shí)間時(shí)間短，產(chǎn)香能力最為突出，保水率、表觀(guān)黏度等指標(biāo)均為最優(yōu)，感官評(píng)分可達(dá)91.6 分，為最優(yōu)的復(fù)合發(fā)酵菌株組合方案，菌株組成為L(zhǎng).delbrueckiisubsp.bulgaricus（BSTS6-4和BSTS6-3）、S.thermophilusXSXN1-1以及L.fermentumBST2-3，菌種接種比例為1∶1∶1∶1。