王永杰，魏丹丹，王慧娟，曹建霞，李潔雅*

(1.河南省職業(yè)病防治研究院，河南 鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046)

反復(fù)呼吸道感染(Recurrent respiratory tract infections，RRTI)是兒科一種常見病，發(fā)病率約20%。RRTI是指1年內(nèi)頻繁發(fā)生上、下呼吸道感染[1]。小兒反復(fù)呼吸道感染的病因十分復(fù)雜，如偏食營養(yǎng)不良、兒童被動吸煙、大氣污染、細菌及病毒感染等均可誘發(fā)小兒RRTI[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認為，RRTI的防治過程中單用抗生素治療療效局限，因此應(yīng)從機體免疫功能入手，通過增強與改善免疫功能達到治療疾病的目的。

中醫(yī)學(xué)中沒有RRTI病名的記載，但是從該病臨床癥狀來看，屬于“體虛感冒”“久嗽”“虛證”“自汗”等范疇[3]。其病機是肺、脾、腎三臟虛損而致衛(wèi)外不固，反復(fù)感邪，病性多為本虛標(biāo)實，其發(fā)病關(guān)鍵是正虛[4]，可采用健脾益氣、培土生金法治療兒童反復(fù)上呼吸道感染。參苓白術(shù)散出自《太平惠民合劑局方》，方中黨參、白術(shù)、茯苓、甘草健脾益氣和中；山藥、炒扁豆、薏苡仁、蓮子補脾滲濕止瀉；陳皮行氣止痛，醒脾濕和胃；砂仁、陳皮調(diào)氣行滯;是培土生金的代表方劑，臨床用于治療RRTI療效顯著。因此，本研究通過觀察參苓白術(shù)散對RRTI大鼠模型肺功能及免疫功能的影響，探討其作用機制，為臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗試劑

大鼠IgA、IgG、IgM、TNF-α、IL-1β、IL-4 ELISA試劑盒(武漢純度生物科技有限公司，批號分別為：201706，201705，201706，201708，201708，201707)；生理鹽水(安徽環(huán)球藥業(yè)股份有限公司，批號：A150524D)；參苓白術(shù)散(北京同仁堂股份有限公司，批號：15101017)；水合氯醛(西安天正藥用輔料有限公司，批號：20160801)；NF-κB p65、β-actin一抗及辣根過氧化物酶二抗(Cell Signaling, Beverly, MA, USA)；ECL A液與B液(P0018，碧云天，上海)。

1.1.2 實驗動物

SD大鼠50只，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半，購自山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK(晉)20150001，實驗室溫度20 ℃～25 ℃，濕度50%～60%，實驗期間動物自由飲水?dāng)z食。

1.1.3 實驗儀器

MultiskanFC酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific 美國)；BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)(BL-420F成都泰盟軟件有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型建立、分組及給藥

SD大鼠50只適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，自由攝食飲水，之后將大鼠隨機分為5組，每組10只，分別為正常組、模型組和參苓白術(shù)散低、中、高劑量組。除正常組外其余大鼠參照陳小野的《實用中醫(yī)證候動物模型學(xué)》[5]介紹的造模方法略作修改進行造模，具體方法如下：每日將大鼠置于深35 cm，水溫30 ℃水池中，使其游泳至耐力極限(耐力極限標(biāo)準(zhǔn)：大鼠口鼻首次浸入水中)，連續(xù)34 d，造模過程中大鼠自由飲水，單日以白菜(20 g/只)代替飼料進行喂養(yǎng)，雙日以豬油脂15 mL/kg灌胃，并給予足量飼料喂養(yǎng)，以疲勞結(jié)合飲食失節(jié)法誘導(dǎo)脾氣虛證；于造模后第13天，采用刨花加煙葉各15 g煙熏大鼠，每天30 min，連續(xù)22 d，誘導(dǎo)肺氣虛證。造模后大鼠出現(xiàn)精神萎靡、消瘦、咳嗽、呼吸急促、毛發(fā)枯槁易脫、弓背、瞇眼、游泳耐力下降、浮便等癥狀，說明造模成功。造模同時，正常組及模型組大鼠灌胃生理鹽水，參苓白術(shù)散低、中、高劑量組大鼠于造模同時灌胃參苓白術(shù)散水溶液。給藥劑量分別相當(dāng)于人用藥量5倍，即1.34 g/(kg·d)；10倍，即2.66 g/(kg·d)；20倍，即5.32 g/(kg·d)。

1.2.2 肺功能測定

以300 mg/kg水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠背位固定于手術(shù)臺上，在頸部做一長約2 cm的縱向切口，鈍性分離氣管，在氣管上做一倒“T”型切口，將“Y”型氣管插管插入氣管中并固定，將插管一端與生物信號采集系統(tǒng)呼吸傳感器相連，描記呼吸運動曲線，測定大鼠每分鐘通氣量(MV)、呼氣峰流量(PEF)及吸氣峰流量(PIF)等指標(biāo)。

1.2.3 血液樣品采集

肺功能測定結(jié)束后，大鼠腹主動脈采血，分離血清，以酶聯(lián)免疫法檢測血清IgA、IgG、IgM、TNF-α、IL-1β、IL-4 表達水平。

1.2.4 支氣管肺泡灌洗液采集

腹主動脈取血后，取出氣管插管，以1 mL注射器抽取0.5 mL生理鹽水，緩慢注入氣管，并以拇指和食指按摩胸部10 s，并反復(fù)抽吸3次，回收灌注液，重復(fù)2次(保證每次灌洗回收率在80%左右)，合并2次灌洗液，4 ℃，2 000 r/min，離心5 min，取上清液，以酶聯(lián)免疫法檢測sIgA含量。

1.2.5 氣管組織標(biāo)本采集

支氣管肺泡灌洗液采集結(jié)束后，分離氣管，-80 ℃保存，用于蛋白含量檢測。

1.2.6 酶聯(lián)免疫法檢測sIgA含量

充分暴露腹腔，取全小腸(從幽口至回盲部)，以適當(dāng)壓力用帶有小鼠灌胃針頭的5 mL注射器向腸腔內(nèi)注入3 mL生理鹽水，使生理鹽水在腸腔內(nèi)保留3 min，并輕輕晃動，收集灌注液，4 ℃，3 000 r/min，離心10 min，取上清液，以酶聯(lián)免疫法檢測sIgA含量。

1.2.7 Western blot法

常規(guī)方法提取氣管組織總蛋白，測定其蛋白濃度，將蛋白濃度稀釋至同一濃度；制備 SDS-PAGE凝膠；電泳；轉(zhuǎn)膜；5%脫脂牛奶封閉過夜；加入NF-κB p65一抗(稀釋比例1∶1 000)；室溫孵育2 h，0.05%TBS-T清洗3次，每次10 min，PBS清洗1次；加入二抗(HRP標(biāo)記的二抗1∶50 000)，室溫孵育3 h，0.05%TBS-T洗3次，PBS清洗1次，每次10 min；在發(fā)光成像系統(tǒng)中進行ECL顯色、曝光、拍攝；對條帶進行相對光密度分析，通過與內(nèi)參β-actin的條帶光度值的比值間接反映NF-κB p65的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 參苓白術(shù)散對RRTI模型大鼠肺功能的影響

與正常組比較，模型組PIF、PEF及MV均降低(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組比較，參苓白術(shù)散干預(yù)后大鼠PIF、PEF及MV均有升高趨勢，其中，中劑量組PIF及MV顯著性升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，高劑量組PIF、PEF及MV極顯著性升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 參苓白術(shù)散對RRTI模型大鼠肺功能的影響

2.2 參苓白術(shù)散對RRTI模型大鼠免疫功能的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清IgA、IgG、IgM、支氣管肺泡sIgA均降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，小腸灌洗液sIgA有降低趨勢，但與正常組比較差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義；參苓白術(shù)散可升高大鼠血清IgA、IgG、IgM水平，增加支氣管及腸道sIgA的分泌水平，并具有一定的劑量依賴性，其中低劑量組大鼠血清IgA、IgG及支氣管肺泡sIgA水平顯著性升高，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；中劑量組大鼠血清IgA、IgG、IgM水平顯著性升高，支氣管肺泡及小腸sIgA水平也顯著性升高，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；高劑量組大鼠血清IgA、IgG、IgM、支氣管肺泡及小腸sIgA均顯著性升高(P<0.01)。見表2。

表2 參苓白術(shù)散對RRTI模型大鼠免疫功能的影響

2.3 參苓白術(shù)散對RRTI模型大鼠血清TNF-α、IL-1β及IL-4水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β及IL-4水平均顯著性升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較,參苓白術(shù)散低、中、高劑量均可降低大鼠血清TNF-α、IL-1β及IL-4水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

表3 參苓白術(shù)散對RRTI模型大鼠血清TNF-α、IL-1β及IL-4水平的影響

2.4 參苓白術(shù)散對RRTI模型大鼠氣管NF-κB p65表達水平的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠氣管NF-κB p65表達水平極顯著性升高(P<0.01)；與模型組比較,參苓白術(shù)散低、中、高劑量均可抑制大鼠氣管NF-κB p65表達水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖1 參苓白術(shù)散對RRTI模型大鼠氣管NF-κB p65表達水平的影響

3 討論

RRTI是兒科的常見病、多發(fā)病，反復(fù)發(fā)病會使患兒肺功能降低，影響兒童的生活質(zhì)量[6]。然而，目前關(guān)于兒童反復(fù)呼吸道感染的研究多局限于臨床，這可能與中醫(yī)“證”的主觀不確定性，導(dǎo)致動物造模方法存在較多爭議有關(guān)，由此也限制了對該病的實驗室研究。本實驗根據(jù)兒童RRTI臨床證候特點，參照陳小野《實用中醫(yī)證候動物模型學(xué)》介紹的造模方法，通過疲勞結(jié)合飲食失節(jié)+煙熏法誘導(dǎo)脾肺氣虛RRTI大鼠模型。造模后大鼠出現(xiàn)精神萎靡、消瘦、咳嗽、呼吸急促、毛發(fā)枯槁易脫、弓背、瞇眼、游泳耐力下降、浮便等癥狀，說明造模成功。RRTI在中醫(yī)學(xué)中屬于體虛感冒的范疇，治以健脾益氣、培土生金，參苓白術(shù)散是培土生金的代表方劑，但其作用機制仍不明確，因此，本研究通過觀察參苓白術(shù)散對RRTI大鼠模型肺功能及免疫功能的影響，探討其作用機制，為臨床用藥提供依據(jù)。

由于兒童免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未成熟，因此，免疫功能低下是兒童易患RRTI的主要原因，IgG、IgA及IgM是免疫球蛋白的三種主要亞型，可發(fā)揮結(jié)合、中和病毒等作用，是機體體液免疫的重要組成部分[7]。特別是IgA及IgG，對患兒呼吸道黏膜具有保護作用，若其分泌量明顯不足，會導(dǎo)致病毒及細菌反復(fù)侵襲上下呼吸道黏膜進而導(dǎo)致兒童RRTI[8]。IgA分為血清型IgA和分泌型IgA(sIgA)兩種，一般情況下，血清型IgA降低常伴sIgA降低[9]。sIgA主要存在于唾液、淚液、呼吸道、消化道及泌尿生殖道等黏膜表面分泌液中，是黏膜免疫的主要效應(yīng)分子[10-11]，可以阻止病原微生物在局部的入侵黏附，并能增強吞噬、抗病毒、抗毒素、溶菌等作用[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，呼吸道黏膜表面sIgA缺乏，是呼吸道感染的主要原因[14]。本研究發(fā)現(xiàn)參苓白術(shù)散可增強RRTI模型大鼠的肺功能，升高血清IgA、IgG、IgM表達水平，同時增加支氣管肺泡及腸道sIgA的分泌，提高機體免疫功能。

TNF-α是一種由內(nèi)毒素激活淋巴細胞及巨噬細胞等分泌的多活性細胞因子，與腫瘤、發(fā)熱、感染等癥狀的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，臨床研究發(fā)現(xiàn)小兒上呼吸道感染時血清TNF-α水平明顯升高[15]。IL-1β是人體內(nèi)另外一種重要的前炎癥細胞因子，可以激活和募集炎癥細胞，加重人體局部炎癥反應(yīng)[16]。此外，輔助性T細胞(Th)在調(diào)節(jié)細胞免疫和體液免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵的作用，臨床研究發(fā)現(xiàn)RRTI患者存在Th1/Th2細胞功能紊亂情況，Th1占優(yōu)勢時，有利于機體病原體的排除和功能恢復(fù)，反之Th2占優(yōu)勢，則會導(dǎo)致感染擴散，病情加重[17]。IL-4是主要活化Th2細胞產(chǎn)生的細胞因子，可促進Th細胞向Th2分化，抑制Th細胞向Th1分化，引發(fā)炎性級聯(lián)反應(yīng)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)RRTI模型大鼠血清TNF-α、IL-1β及IL-4水平均顯著性升高(P<0.01)，這一結(jié)果與陳宏[19]等的臨床研究結(jié)果一致。參苓白術(shù)散可降低RRTI模型大鼠的血清TNF-α、IL-1β及IL-4水平，緩解機體的炎癥反應(yīng)狀態(tài)。進一步的Western blot檢測結(jié)果顯示，參苓白術(shù)散可抑制RRTI模型大鼠氣管NF-κB p65的表達。NF-κB作為一種前炎癥基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在炎癥和免疫反應(yīng)及細胞凋亡過程中起著至關(guān)重要的作用，NF-κB的活化可調(diào)控多種炎癥相關(guān)細胞因子的表達，參與炎癥反應(yīng)。這一結(jié)果提示參苓白術(shù)散可能通過抑制NF-κB的表達進而抑制炎癥因子的生成，減輕炎癥反應(yīng)，改善肺功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，參苓白術(shù)散可提高脾肺氣虛型RRTI高鼠模型免疫功能，降低氣管NF-κB表達水平，進而抑制炎癥因子的生成，這可能是其提高脾肺氣虛型RRTI高鼠模型肺功能，改善RRTI癥狀的作用機制，這一研究成果為參苓白術(shù)散的臨床用藥提供了理論依據(jù)。