徐珊，劉鵬宇，何全中*

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453000)

原發(fā)性痛經(jīng)(Primary dysmenorrheal,PDM)是一種常見的婦科疾病，影響40%～50%的青春期育齡女性人群[1]。這種疾病的特點(diǎn)是在月經(jīng)第1天或第2天出現(xiàn)劇烈的急性腹痛，但沒有明顯的盆腔病變[2]。這些癥狀可伴有腰痛、惡心、嘔吐和腹瀉等癥狀。以往的研究已經(jīng)證明PDM與前列腺分泌異常增加有密切關(guān)系[3]。前列腺素水平異?？梢痤l繁或節(jié)律紊亂的子宮收縮，從而降低子宮血流量，被認(rèn)為是導(dǎo)致月經(jīng)痛的主要因素[1,4]。

非甾體抗炎藥(NSAIDs)是PDM最常見的治療方法[5]。此外，PDM還被證明與性激素和卵巢類固醇相關(guān)疾病有關(guān)。因此，口服避孕藥也被用于治療PDM[6]。盡管非甾體抗炎藥和口服避孕藥的療效迅速且顯著，但對肝、腎、胃腸功能甚至心臟系統(tǒng)都有許多副作用[7]。由于非甾體抗炎藥和口服避孕藥的這些缺點(diǎn)，中藥被認(rèn)為是治療PDM的可行選擇。

白芷為傘形科植物白芷[Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f]或杭白芷[Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.) Shanet Yuan]的干燥根。其性溫，氣芳香，味辛，微苦，具有散風(fēng)除濕、通竅止痛、消腫排膿等功效，此外，白芷還有活血的作用[8]。白芷在臨床主要用于治療感冒頭痛、眉棱骨痛、鼻塞、鼻淵、牙痛、白帶和瘡瘍腫痛等證。而有關(guān)白芷治療原發(fā)性痛經(jīng)性疾病的相關(guān)研究并不多。既往研究發(fā)現(xiàn)，白芷的主要有效成分為香豆素類[9-10]，故本研究選擇川產(chǎn)道地藥材白芷的提取物-總香豆素(Total coumarin of Angelica dahurica，TCAD)為研究對象，旨在探究其是否可以用于治療原發(fā)性痛經(jīng)性疾病及其可能的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試藥

實(shí)驗(yàn)用川白芷飲片(批號：20180306)購于北京同仁堂新鄉(xiāng)藥店。白芷總香豆素的提取[11]：白芷粉末(10目)加入10倍量水加熱至40 ℃，保溫2 h后，3 000 r/min離心15 min，藥渣中加入10倍量70%乙醇，加熱回流2次，每次2 h，提取合并過濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮烘干得白芷香豆素。實(shí)驗(yàn)時用生理鹽水(含0.5%吐溫-80助溶)配成所需濃度的混懸液備用。

1.2 動物

清潔級昆明雌鼠，體質(zhì)量(20±2)g,，購自河南省實(shí)驗(yàn)動物中心,許可證號：SCXK(豫)2015-0005。所有動物均飼養(yǎng)在溫度為22 ℃～24 ℃，相對濕度為60%～65%的房間內(nèi)，所有動物實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，可自由飲水。

1.3 儀器與試劑

谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(南京建成生物工程有限公司)；鈣含量比色檢測分析試劑盒(艾美捷科技有限公司)；小鼠β-內(nèi)啡肽(β-EP)、血栓素B2(TXB2)ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；前列腺素F2α(PGF2α)ELISA試劑盒(廈門慧嘉生物科技有限公司)；6-酮-前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)ELISA試劑盒(上海紀(jì)寧酶聯(lián)生物科技有限公司)；酶標(biāo)儀( Thermo Multiskun Mk3，美國賽默飛世爾科技公司)；張力換能器(成都泰盟軟件有限公司)；BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)。

1.4 PDM模型的建立及動物的分組、給藥

根據(jù)陳景偉等報道的方法建立小鼠PDM模型[12]。60只雌性昆明小鼠分為6組(每組10只)，分別為正常組、模型組、陽性組和白芷總香豆素(TCAD)高、中、低劑量組。除正常組小鼠外，其余各組小鼠均連續(xù)灌胃戊酸雌二醇片12 d(每日0.5 mg/kg)。在造模期間，陽性組小鼠灌胃布洛芬(0.075 g/kg),實(shí)驗(yàn)組小鼠給予不同濃度白芷總香豆素(0.4、0.8、1.6 g/kg)12 d。正常組和模型組小鼠給予生理鹽水(含0.5%吐溫-80)。各組小鼠于末次給藥后1 h腹腔注射催產(chǎn)素(2 U/只)。以小鼠后肢伸直，腹部內(nèi)凹，臀部抬起為扭體指標(biāo)。記錄注射催產(chǎn)素后30 min內(nèi)扭體次數(shù)并計算扭體反應(yīng)抑制百分率。

抑制率(%)=(模型組扭體反應(yīng)均數(shù)-給藥組扭體反應(yīng)均數(shù)) /模型組扭體反應(yīng)均數(shù)×100%

1.5 血清谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及血漿β-內(nèi)啡肽(β-EP)含量的檢測

觀察扭體反應(yīng)30 min后，腹腔注射4%水合氯醛(0.1 mL/10 g)麻醉。眼底靜脈叢取血至不含抗凝劑試管中，室溫靜置1 h，3 000 r/min離心20 min，取上清即為血清。眼底靜脈叢取血至枸櫞酸鈉抗凝管中，3 000 r/min離心20 min，取上清即為血漿。用黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)測定血清SOD活力，比色法測定血清GSH-Px活力，硫代巴比妥酸(TBA)法測定血清MDA含量。使用小鼠β-內(nèi)啡肽(β-EP)ELISA試劑盒檢測血漿β-內(nèi)啡肽含量。以上均嚴(yán)格按照說明書要求操作。

1.6 子宮組織前列腺素F2α(PGF2α)、6-酮-前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)、血栓素B2(TXB2)和鈣離子含量的測定

取血后，于冰上迅速取新鮮小鼠子宮組織，生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分。加入約10倍量生理鹽水，勻漿器勻漿制成子宮內(nèi)膜組織勻漿液，隨后于4 ℃ 3 000 r/min 離心10 min，取上清液，待測。ELISA檢測子宮組織前列腺素F2α(PGF2α)、6-酮-前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)和血栓素B2(TXB2)的含量。以上均嚴(yán)格按說明書要求操作。

1.7 白芷總香豆素對原發(fā)性痛經(jīng)小鼠子宮收縮頻率和幅度的影響

參考文獻(xiàn)[13]，將上述模型動物取血后，立即取小鼠子宮，置于冷洛氏液中清洗，取子宮角，不含脂肪組織，置于恒溫浴槽中，在(37±0.1)℃(調(diào)節(jié)pH值至6.7)的洛氏溶液(20 mL)中孵育，并用氣體(95% O2，5% CO2)鼓泡。子宮角一側(cè)用手術(shù)絲固定在固定柱上，另一側(cè)用張力傳感器固定并連接BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。子宮預(yù)負(fù)荷1.5 g張力，靜置60 min，待子宮收縮頻率和幅度穩(wěn)定后，記錄各組動物子宮平滑肌收縮曲線的頻率和振幅。

1.8 白芷總香豆素對縮宮素引起正常大鼠離體子宮平滑肌收縮力的影響

參考文獻(xiàn)[13]和[14]進(jìn)行。雌性未孕小鼠(18～22 g)使用苯甲酸雌二醇(1 mg/kg)腹腔注射，連續(xù)3 d后，頸椎脫位處死，立即取小鼠子宮，置于冷洛氏液中清洗，取子宮角，不含脂肪組織，置于恒溫浴槽中，在(37±0.1)℃(調(diào)節(jié)pH值至6.7)的洛氏溶液(20 mL)中孵育，并用氣體(95% O2，5% CO2)鼓泡。子宮角一側(cè)用手術(shù)絲固定在固定柱上，另一側(cè)用張力傳感器固定并連接BL-420F系統(tǒng)。子宮預(yù)負(fù)荷1.5 g張力，靜置15 min。然后，加入催產(chǎn)素(0.02 U/mL)，使其反應(yīng)15 min，引起收縮。之后分別向給浴槽中加入32 ℃的3個不同濃度白芷總香豆素溶液，使之在肌槽中終質(zhì)量濃度分別為0.02 g/mL、0.04 g/mL及0.08 g/mL，觀察給藥后10 min離體子宮平滑肌的運(yùn)動曲線。記錄各組子宮平滑肌基線最大的上升高度，同時計算抑制率。

抑制率(%)=(縮宮素組基線的平均上升高度-藥物組基線的平均上升高度)/縮宮素組基線的平均上升高度×100%

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 白芷總香豆素對小鼠扭體反應(yīng)及潛伏期的影響

與正常組比較，模型組小鼠30 min內(nèi)扭體反應(yīng)次數(shù)明顯增高(P< 0.01) ，扭體反應(yīng)潛伏期明顯縮短(P<0.01)。與模型組比較，TCAD中、高劑量組可顯著地減少小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)(P<0.05，P<0.01)，延長扭體反應(yīng)潛伏期(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 各組原發(fā)性痛經(jīng)模型小鼠的潛伏期、扭體次數(shù)影響的比較

2.2 白芷總香豆素對痛經(jīng)小鼠血清SOD、GSH-Px、MDA的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清中MDA含量明顯增高(P<0.01)，SOD、GSH-Px活力明顯降低(P<0.01)，經(jīng)TCAD中、高劑量處理后，可顯著降低MDA含量(P<0.05，P<0.01)，升高SOD、GSH-Px活力(P<0.05，P<0.01)。見表2。

2.3 白芷總香豆素對痛經(jīng)小鼠血漿β-EP含有量的影響

與正常組比較，模型組小鼠漿中β-EP含量明顯降低(P<0.01)，經(jīng)TCAD中、高劑量處理后，β-EP含量顯著升高(P<0.05，P<0.01)。見表3。

表2 各組痛經(jīng)小鼠血清SOD、GSH-Px、MDA影響的比較

表3 各組痛經(jīng)小鼠血漿β-EP含量及子宮組織PGF2α影響的比較

2.4 白芷總香豆素對痛經(jīng)小鼠子宮組織PGF2α的影響

與正常組比較，模型組小鼠子宮內(nèi)PGF2α含量明顯升高(P<0.01),經(jīng)TCAD中、高劑量處理后，PGF2α含量明顯降低(P<0.05，P<0.01)。見表3。

2.5 白芷總香豆素對痛經(jīng)小鼠子宮組織6-Keto-PGF1α、TXB2和6-keto-PGF1α/TXB2的影響

與正常組比較，模型組小鼠子宮內(nèi)TXB2含量明顯升高(P<0.01)，6-Keto-PGF1α含量明顯降低(P<0.05)，6-keto-PGF1α/TXB2下降,經(jīng)TCAD處理后，與模型組比較，低、中、高劑量組TXB2含量明顯降低(P<0.05，P<0.01)，高劑量組6-Keto-PGF1α含量明顯增加(P<0.05),6-keto-PGF1α/TXB2隨著TCAD劑量增加逐漸升高。見表4。

2.6 白芷總香豆素對原發(fā)性痛經(jīng)模型小鼠離體子宮平滑肌收縮頻率和幅度的影響

與正常組相比，模型組離體子宮平滑肌的收縮頻率明顯增多、收縮幅度明顯降低(P<0.01),TCAD中、高劑量組離體子宮收縮頻率明顯低于模型組(P<0.05，P<0.01)，收縮幅度高于模型組(P<0.05)。見表5。

表4 各組痛經(jīng)小鼠子宮組織6-Keto-PGF1α、TXB2和6-keto-PGF1α/TXB2影響的比較

表5 各組原發(fā)性痛經(jīng)小鼠子宮收縮頻率和幅度影響的比較

2.7 白芷總香豆素對縮宮素誘發(fā)子宮平滑肌痙攣性收縮作用的影響

與縮宮素組相比，終濃度為0.02 g/mL，0.04 g/mL及0.08 g/mL的白芷總香豆素組，子宮收縮基線上升的幅度顯著降低 (P<0.05，P<0.01)。見表6。

表6 各組縮宮素誘發(fā)子宮平滑肌痙攣性收縮作用影響的比較

3 討論

催產(chǎn)素誘發(fā)的小鼠模型被認(rèn)為是痛經(jīng)的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)小鼠模型，并經(jīng)常用于原發(fā)性痛經(jīng)研究[15]。由于強(qiáng)烈急性腹痛是原發(fā)性痛經(jīng)的主要臨床癥狀，故以扭體反應(yīng)為主要指標(biāo)，以扭體次數(shù)為指標(biāo)評價模型及實(shí)驗(yàn)藥物的療效。本研究中，白芷總香豆素可通過降低PDM模型小鼠的扭體反應(yīng)而呈劑量依賴性地顯示鎮(zhèn)痛活性。另外，TCAD中、高劑量組離體子宮收縮頻率明顯低于模型組(P<0.05，P<0.01)，收縮幅度高于模型組(P<0.05)，說明白芷總香豆素可有效地抑制縮宮素引起的子宮平滑肌痙攣性收縮。與縮宮素組相比，終濃度為0.02 g/mL、0.04 g/mL及0.08 g/mL的白芷總香豆素組，子宮收縮基線上升的幅度顯著降低(P<0.05，P<0.01)，說明白芷總香豆素可拮抗縮宮素誘發(fā)的小鼠子宮平滑肌的痙攣性收縮。

研究表明，PDM的病因是由于子宮前列腺素(PGs)分泌過多導(dǎo)致子宮收縮異常[16]。前列腺素F2α(PGF2α)、6-酮-前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α，前列環(huán)素的穩(wěn)定代謝物)和血栓素B2(TXB2，TXA2的代謝物)是在環(huán)氧化酶(COX)的作用下通過花生四烯酸產(chǎn)生的幾種主要PGs，已被證明是PDM發(fā)病的主要因素[17-18]。PGF2α和TXA2分別是子宮收縮和血管收縮的強(qiáng)刺激物[19-20]。特別是前列腺素2α(PGF2α)，可刺激子宮收縮和缺血，導(dǎo)致月經(jīng)痛[21]。因此，PGF2α和TXA2不僅可以增加子宮內(nèi)的張力，減少血流，而且可以促進(jìn)血栓形成。前列環(huán)素(PGI2)通過擴(kuò)張血管、預(yù)防血小板聚集和血栓形成來緩解PDM癥狀[17,19,22]。由于PGI2和TXA2的半衰期非常短[23]，筆者通過檢測它們的代謝物6-Keto-PGF1α和TXB2，以間接反映它們的水平。臨床研究表明，PDM患者的PGF2α和TXB2水平明顯高于無癥狀正常人[24]，而PDM患者的6-keto-PGF1α水平則相反[19-20]。同時6-keto-PGF1α/TXB2水平升高則被認(rèn)為是PDM臨床療效的指標(biāo)[19]。本研究中，與正常組比較，模型組小鼠子宮內(nèi)PGF2α、TXB2含量明顯升高(P<0.01)，6-Keto-PGF1α含量降低(P<0.05)，6-keto-PGF1α/TXB2下降。經(jīng)TCAD中、高劑量處理后，PGF2α、TXB2含量明顯降低(P<0.05，P<0.01)，6-Keto-PGF1α含量增加(P<0.05)，6-keto-PGF1α/TXB2升高。

此外現(xiàn)代研究表明，β-內(nèi)啡肽(β-EP)是一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，具有內(nèi)源性鎮(zhèn)痛作用[25]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TCAD可顯著增加血漿的β-EP含量，這可能是其緩解PDM疼痛的機(jī)制之一。

有研究稱PDM會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激反應(yīng)加速[7]，這將降低抗氧化酶活性如谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)，并增加游離氧自由基及丙二醛(MDA)的水平[26]，從而導(dǎo)致更強(qiáng)和更頻繁的子宮收縮和缺血。當(dāng)發(fā)生子宮內(nèi)膜異位癥時，子宮肌層血流減少，子宮缺血導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激過多。脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激可能在PDM的基礎(chǔ)機(jī)制中起重要作用[27]。MDA是脂質(zhì)過氧化的最后產(chǎn)物，它反映了脂質(zhì)過氧化程度[28]。GSH-Px是對抗自由基的最重要的抗氧化劑之一，并防止隨后的脂質(zhì)過氧化[29]。本研究中，與正常組比較，模型組小鼠血清中MDA含量明顯增高(P<0.01)，SOD、GSH-Px活性明顯降低(P<0.01)，而經(jīng)TCAD中、高劑量處理后，可顯著降低MDA含量(P<0.05，P<0.01)，升高SOD、GSH-Px活力(P<0.05，P<0.01)。這說明TCAD可能通過減輕肌層細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激而發(fā)揮抗PDM的潛在鎮(zhèn)痛作用。

綜上所述，白芷總香豆素能有效改善實(shí)驗(yàn)性PDM，其機(jī)制可能與抗氧化、降低PGF2α水平，升高6-keto-PGF1α/TXB2水平及β-內(nèi)啡肽含量有關(guān)。