蔣鵬飛，彭俊，吳大力，彭清華,3*

(1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.中醫(yī)藥防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；4.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023)

隨著激光在眼科檢查及治療的廣泛應(yīng)用，由激光所致的醫(yī)源性視網(wǎng)膜光損傷也越來越多，長期光照的積累效應(yīng)對視網(wǎng)膜有損傷作用，可誘導多種眼科疾病[1-2]，如老年性黃斑變性。早在《晉書》中就有蠐螬在眼科的應(yīng)用記載，研究表明蠐螬對光損傷所致視網(wǎng)膜變性有治療作用[3]。為明確其作用機制，本實驗對視網(wǎng)膜光損傷后凋亡因子Caspase-8 mRNA、 Bax mRNA、Bid mRNA、Caspase-3 mRNA的表達進行了檢測，探討了不同劑量蠐螬提取物對視網(wǎng)膜光損傷兔模型的保護作用。

1 材料

1.1 實驗動物

30只雄性健康實驗性兔(湖南中醫(yī)藥大學動物實驗室提供，合格證號：醫(yī)動字第20-002號)。

1.2 實驗儀器

臺式冷凍離心機(湘儀，TGL-16)；普通冰箱(榮事達，BCD-245F)；精密pH計(雷磁，E-201-C)；電子天平(民橋，F(xiàn)A-N)；超凈工作臺(北京亞泰隆，YT-CJ-2NB)；直熱式二氧化碳培養(yǎng)箱(上海三藤儀器，DH-160I)；倒置生物顯微鏡(北京中顯恒業(yè)儀器，DSZ2000X)；熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS，IX51)；-80 ℃冰箱(中科美菱，DW-HL388)；恒溫水浴箱(J-MAX，HH-2)；搖床(其林貝爾，TS-92)；恒溫箱(北京六一，DYY-6C)；微波爐(美的，MM721AAU-PW)；顯微鏡(奧林巴斯，CX41-72C02)；酶標儀(匯松，MB-530)；熒光定量RCP儀(Thermo，PIKOreal 96)；熒光PCR板(Thermo，SPL0960)。

1.3 主要實驗藥品和試劑

蠐螬提取物(參照譚涵宇等[3]所用制備方法制取)；瓊脂糖(西班牙)；EDTA(Sigma)；Tris(Sigma)、Trizol(Invitrogen);Taq酶(Genstar)；DL2000 DNA Marker(Genstar)；dNTP(Genstar)；E.B.(Sigma)；SYBGREEN PCR Mix Mix(ABI)；DL2000 DNA Marker(Genstar)；dNTP(Genstar)；SYBGREEN PCR Mix Mix(ABI)。

2 實驗方法

2.1 分組方法

采用隨機數(shù)字表將30只兔隨機平均分為空白組、模型組、蠐螬低劑量組、蠐螬中劑量組和蠐螬高劑量組。

2.2 造模方法

采用自制光化學損傷裝置[3]對實驗兔進行36 h的光照，光照后送回暗環(huán)境中飼養(yǎng)?？瞻捉M不施行光照試驗。

2.3 給藥方法

空白組和模型組以生理鹽水5 mL/kg灌胃；蠐螬低劑量組按0.45 g/kg配成5 mL蠐螬提取物混懸液；蠐螬中劑量組按0.9 g/kg蠐螬提取物配成5 mL蠐螬提取物混懸液；蠐螬高劑量組按1.8 g/kg蠐螬提取物配成5 mL蠐螬提取物混懸液。每日灌胃1次，給藥14 d后處死全部兔子后取材。

2.4 取材方法

動物耳緣靜脈注射空氣處死后，立即摘除眼球，在手術(shù)顯微鏡下仔細剝離激光斑部位視網(wǎng)膜，備行PCR檢測Caspase-8 mRNA、 Bax mRNA、Bid mRNA、Caspase-3 mRNA的表達。

2.5 指標檢測

2.5.1 HE染色觀察標本視網(wǎng)膜細胞結(jié)構(gòu)

經(jīng)脫水、脫蠟、洗蠟、乙醇浸泡、水洗、染色、分色等步驟，在光學顯微鏡下觀察并拍照。

2.5.2 RT-qPCR法檢測視網(wǎng)膜Caspase-8 mRNA、 Bax mRNA、Bid mRNA、Caspase-3 mRNA的表達

參照Gene Bank數(shù)據(jù)庫中各目的基因的序列下載基因序列，用 primer premier 6.0進行引物設(shè)計，設(shè)計的引物由武漢賽維爾生物科技有限公司合成，具體引物序列如表1所示。實驗加入試劑見表2；加入冷卻反應(yīng)液中的試劑見表3。

表1 引物序列表

表2 加入試劑名稱及量

表3 加入冷卻反應(yīng)液中的試劑及量

2.6 統(tǒng)計學處理

3 結(jié)果

3.1 各組實驗性兔視網(wǎng)膜組織HE染色結(jié)果

空白組：實驗性兔視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次分明。模型組：視網(wǎng)膜層次結(jié)構(gòu)模糊，分界不清，出現(xiàn)不規(guī)則淡染。蠐螬低劑量組：視網(wǎng)膜外核層胞核排列較疏松。蠐螬中劑量組：視網(wǎng)膜外核層胞核排列較整齊密集。蠐螬高劑量組：視網(wǎng)膜外核層胞核排列較整齊，厚度有增加。見圖1。

注：A.空白組；B.模型組；C.蠐螬低劑量組；D.蠐螬中劑量組；E.蠐螬高劑量組。圖1 各組實驗性兔視網(wǎng)膜組織HE染色結(jié)果(×400)

3.2 各組視網(wǎng)膜Caspase-8 mRNA、 Bax mRNA、Bid mRNA、Caspase-3 mRNA表達情況

各組視網(wǎng)膜組織中檢測指標Caspase-8 mRNA、Bid mRNA相對表達量空白組與模型組比較均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，空白組與蠐螬低、中、高劑量組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，模型組與蠐螬低、中、高劑量組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，蠐螬低、中、高劑量組兩兩比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；各組視網(wǎng)膜組織中檢測指標Bax mRNA、Caspase-3 mRNA相對表達量空白組與模型組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，空白組與蠐螬低、中、高劑量組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，模型組與蠐螬低、中、高劑量組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，蠐螬中、高劑量組與蠐螬低劑量組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組視網(wǎng)膜組織Caspase-8 mRNA、Bax mRNA、Bid mRNA、Caspase-3 mRNA相對表達量比較

4 討論

眼底激光作為高能量的單色光，對視網(wǎng)膜的灼傷屬于眼外傷范疇，多導致視衣氣陰受損，氣虛血瘀。目珠脈道幽深細微，經(jīng)絡(luò)分布周密，氣血縱橫貫目，若激光灼傷目珠，氣陰受損，脈絡(luò)瘀滯，使神光發(fā)越受阻，視功能減退。目得陰血而能視，氣脫者目不明，神光賴其真氣、真血、真精之滋養(yǎng)，方能明視萬物。益氣則神光有所滋養(yǎng)，同時，氣旺以促血行；活血化瘀則目珠脈道通暢，氣血可以縱橫貫目，神光方能有所發(fā)越。故治療常以益氣活血化瘀為主，輔以養(yǎng)陰利水。

蠐螬有破血、行瘀、散結(jié)、通乳之功效，《神農(nóng)本草經(jīng)》中最早有記載：“主惡血血瘀痹氣，破折血在脅下堅滿痛，月閉，目中淫膚、青翳白膜。”前期研究發(fā)現(xiàn)蠐螬對血-視網(wǎng)膜屏障有保護作用[4]，有抑制視網(wǎng)膜新生血管的作用[5]，對視網(wǎng)膜靜脈阻塞后視網(wǎng)膜感光細胞有保護作用[6-7]。當光照損傷了視網(wǎng)膜，視網(wǎng)膜感光細胞發(fā)生慢性氧化應(yīng)激反應(yīng)[8-9]，逐漸凋亡[10]。感光細胞的大量凋亡后，視力會急劇下降[11-12]。

Caspase-8是凋亡的起始因子，Caspase-8激活后視網(wǎng)膜感光細胞發(fā)生凋亡，Bax與Bid均是促凋亡蛋白，可將凋亡信號傳導至線粒體[13-14]，同時Bid還可以促進Bax向線粒體膜的插入和多聚體的形成。Caspase-3是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑的最終凋亡因子[15]，只有Caspase-3的表達增高，才能說明發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑[16]。

本實驗發(fā)現(xiàn)模型組Caspase-8、Bax、Bid、Caspase-3 mRNA表達增加，蠐螬低、中、高劑量組Caspase-8、Bax、Bid、Caspase-3 mRNA表達減少。提示視網(wǎng)膜光損傷可能通過激活細胞凋亡的死亡受體通路，引起光感受器細胞凋亡導致視網(wǎng)膜損傷；蠐螬可能通過抑制細胞凋亡的死亡受體通路活化，最終達到有效拮抗光損傷誘導的光感受器細胞的凋亡。

綜上所述，蠐螬通過抑制了視網(wǎng)膜感光細胞凋亡因子Caspase-8、Bax、Bid、Caspase-3 mRNA的相對表達，從而抑制了視網(wǎng)膜感光細胞的凋亡，改善視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)，改善了視功能。其療效與劑量相關(guān)，中、高劑量療效較好。