于書娟 劉洪臣

骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療不僅是一個(gè)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)面臨的問(wèn)題，也是一個(gè)社會(huì)問(wèn)題。在1993 年，骨質(zhì)疏松癥被定義為一種系統(tǒng)性的骨疾病，并且以骨量丟失，骨微結(jié)構(gòu)退化，骨脆性和骨折增加為特點(diǎn)。由于全身骨量丟失和頜骨骨量丟失的相關(guān)性[1]，許多用于系統(tǒng)性骨質(zhì)疏松癥的藥物用于研究對(duì)頜骨骨量的影響[2，3]。其中依普黃酮作為一種廣受關(guān)注的藥物，其在臨床上的應(yīng)用前景很大[4，5]。我們之前的實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)來(lái)源于骨質(zhì)疏松大鼠頜骨的成骨細(xì)胞在增殖和分化上均有改變[6]，并且低濃度的雌二醇對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細(xì)胞的生物學(xué)活性有影響[7]。所以本研究主要關(guān)注依普黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細(xì)胞增殖和分化的影響，從而更進(jìn)一步探索依普黃酮在口腔醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用，為頜骨骨質(zhì)疏松的防治提供一定的研究基礎(chǔ)。

1.材料和方法

1.1 動(dòng)物模型 所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)同意。20 只約三個(gè)月大的Sprague-Dawley (SD)大鼠(300g，軍事醫(yī)科院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，北京，中國(guó))，隨機(jī)分成兩個(gè)相同數(shù)量的組，一組作為假手術(shù)組，卵巢附近的一小塊脂肪組織被摘除；另一組作為去勢(shì)組，行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)。

1.2 成骨細(xì)胞分離和培養(yǎng) 手術(shù)后12 周[8]，去勢(shì)組和假手術(shù)組通過(guò)血清中雌二醇水平和頜骨骨密度等進(jìn)行比較，成功建立骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型后，全麻下處死去勢(shì)組大鼠，無(wú)菌條件下取下頜骨，在文獻(xiàn)基礎(chǔ)上分離培養(yǎng)成骨細(xì)胞[6]。當(dāng)培養(yǎng)的成骨細(xì)胞在培養(yǎng)板中融合到80%以上時(shí)，無(wú)血清培養(yǎng)基使成骨細(xì)胞同步化。將依普黃酮稀釋，得到實(shí)驗(yàn)所需的濃度0M、10-9M、10-8M、10-7M 和10-6M。含不同濃度依普黃酮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)成骨細(xì)胞72h。然后進(jìn)行四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)法、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和骨鈣素(osteocalcin，OC)測(cè)定。

1.3 MTT 法 將成骨細(xì)胞接種在96 孔板中(1×104個(gè)細(xì)胞/ ml；200μl/ 孔)24 小時(shí)后，換成無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 小時(shí)，使細(xì)胞同步化。然后用含不同濃度依普黃酮的培養(yǎng)基(0M、10-9M、10-8M、10-7M 和10-6M)分別培養(yǎng)72 小時(shí)。接著在每孔中加入20μl 的MTT 溶液，在37℃下持續(xù)孵育4 小時(shí)。抽吸MTT 培養(yǎng)基后，用二甲基亞砜取代。在酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)器(ELx800 紫外型，Bio-Tek，美國(guó))上以490 nm 的波長(zhǎng)讀取數(shù)值。

1.4 堿性磷酸酶活性測(cè)定 將成骨細(xì)胞接種于12 孔板(1×105細(xì)胞/ ml；1ml/ 孔)中，在5%CO2和37℃下生長(zhǎng)。第二天，用無(wú)血清培養(yǎng)基將細(xì)胞同步化培養(yǎng)24 小時(shí)，然后分別加入所配制濃度依普黃酮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 小時(shí)。用PBS 清洗成骨細(xì)胞后，加入0.1%Triton X-100(300μl)在4℃下過(guò)夜裂解。將50μl 裂解物轉(zhuǎn)移到另一96 孔板中，并添加50μl 的4.5mmol/ l 對(duì)硝基苯磷酸鹽。然后將該96 孔板在37℃下再孵育30 分鐘。向每個(gè)孔中添加50μl 的0.1M 氫氧化鈉終止反應(yīng)。在405nm 波長(zhǎng)下測(cè)量產(chǎn)物的光密度。采用蛋白質(zhì)分析(BCA 蛋白分析試劑盒，博斯特，中國(guó))使蛋白質(zhì)一致化。

1.5 骨鈣素測(cè)定 將骨質(zhì)疏松頜骨的成骨細(xì)胞接種于12 孔板(1×105細(xì)胞/ ml；1ml/ 孔)，并且用無(wú)血清培養(yǎng)基將細(xì)胞同步化培養(yǎng)24 小時(shí)后，分別加入所配制濃度的依普黃酮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)。收集細(xì)胞培養(yǎng)基，并使用自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析法(瑞士羅氏Cobas E601)檢測(cè)培養(yǎng)基中的骨鈣素含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。通過(guò)方差分析(ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，在達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著性時(shí)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖訖z驗(yàn)。P 值等于或小于0.05 被認(rèn)為是顯著性的差別。

2.結(jié)果

2.1 成骨細(xì)胞生長(zhǎng)觀察結(jié)果 骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細(xì)胞(見(jiàn)圖1)，在無(wú)藥組中培養(yǎng)第5～7 天時(shí)，細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶。在依普黃酮干預(yù)組中，成骨細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶的速度明顯提高，比對(duì)照組快約1～2 天。

圖1 骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細(xì)胞(×100)

2.2 MTT 檢測(cè)結(jié)果 依普黃酮干預(yù)培養(yǎng)骨質(zhì)疏松頜骨成骨細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，含有依普黃酮組(10-9M、10-8M、10-7M 和10-6M)MTT 值均明顯高于不含依普黃酮組(圖2)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中不同濃度之間也有明顯差異(P＜0.05)，10-8M濃度的MTT 檢測(cè)值最高，其次是10-9M、然后是10-6M 和10-7M。

圖2 依普黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細(xì)胞MTT 值檢測(cè)的影響(*，P＜0.05)

2.3 堿性磷酸酶檢測(cè)結(jié)果 通過(guò)檢測(cè)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶含量，并且蛋白質(zhì)量一致后，結(jié)果(圖3)顯示含依普黃酮組堿性磷酸酶含量明顯高于不含依普黃酮組，P＜0.01。各濃度之間有明顯差異，表現(xiàn)規(guī)律與MTT 檢測(cè)值規(guī)律和細(xì)胞的觀察生長(zhǎng)速度規(guī)律基本一致，并且，10-8M 組最高，P＜0.01。

圖3 依普黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細(xì)胞ALP 活性的影響(*，P＜0.01)

2.4 骨鈣素分泌量 見(jiàn)圖4。與不含依普黃酮組相比，依普黃酮組成骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中骨鈣素分泌量明顯增多，P＜0.01。各濃度之間也有明顯差異(P＜0.01)，其表現(xiàn)規(guī)律與MTT 檢測(cè)、ALP檢測(cè)和細(xì)胞的觀察生長(zhǎng)速度規(guī)律略有不同，10-8M濃度的MTT 檢測(cè)值最高，其次是10-7M、然后是10-6M，四種濃度中最低的是10-9M。

圖4 依普黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細(xì)胞骨鈣素水平檢測(cè)的影響(*，P＜0.01)

3.討論

近年來(lái)，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注系統(tǒng)性骨質(zhì)疏松癥對(duì)口腔頜骨的影響，有研究報(bào)道，發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥對(duì)種植體近中和遠(yuǎn)中的邊緣骨丟失有顯著影響[9]；并且骨質(zhì)疏松癥患者與牙周炎的臨床附著喪失和牙槽骨骨丟失相關(guān)，骨質(zhì)疏松癥是牙周炎的一個(gè)高危因素，建議臨床上牙周炎和骨質(zhì)疏松癥同時(shí)考慮[10]。同時(shí)建議種植體植入時(shí)要充分權(quán)衡使用治療骨質(zhì)疏松癥的藥物(如雙磷酸鹽類)對(duì)頜骨的影響[11]。依普黃酮作為一種有效的防治骨質(zhì)疏松的藥物，因?yàn)槠漭^小的副作用在我國(guó)得到了廣泛的應(yīng)用。依普黃酮可以通過(guò)阻斷Ihh 信號(hào)通路從而減輕軟骨退變[12]。并且，還通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和減少破骨細(xì)胞數(shù)量從而促進(jìn)新骨生成和抑制骨吸收[13]；通過(guò)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨，改善骨質(zhì)量并保護(hù)骨組織[14]。但是，由于頜骨含有牙齒有其獨(dú)特性，對(duì)于依普黃酮對(duì)頜骨影響的研究很是必要。已經(jīng)有研究報(bào)道依普黃酮可以增加頜骨骨小梁和骨皮質(zhì)的骨密度，提示了依普黃酮對(duì)頜骨結(jié)構(gòu)的影響[15]。我們通過(guò)對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細(xì)胞的培養(yǎng)，為依普黃酮對(duì)頜骨影響的研究提供了一種更好的方式，也為口腔醫(yī)學(xué)的進(jìn)一步研究提供了細(xì)胞基礎(chǔ)。

前期本研究組已經(jīng)對(duì)骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的成功建立和去勢(shì)組與假手術(shù)組之間的成骨細(xì)胞的區(qū)別進(jìn)行過(guò)報(bào)道[6]。本次實(shí)驗(yàn)主要是研究依普黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松成骨細(xì)胞的影響。并且之前我們研究表明低濃度雌二醇對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠下頜骨成骨細(xì)胞有明顯的促進(jìn)增殖和分化的作用[7]。而依普黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松成骨細(xì)胞的影響，在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)MTT 法、ALP 法和OC 法檢測(cè)結(jié)果也表明，依普黃酮能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，促進(jìn)堿性磷酸酶和骨鈣素分化，從而使成骨細(xì)胞發(fā)揮更大的作用，在整個(gè)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的骨平衡中占據(jù)更主要的地位，使得成骨大于破骨，對(duì)骨質(zhì)疏松頜骨起到防治作用，相應(yīng)地對(duì)骨質(zhì)疏松癥患者的種植手術(shù)的成功和長(zhǎng)期效果也會(huì)起到一定的作用。同時(shí)，該研究還表明不同濃度的依普黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠頜骨成骨細(xì)胞的增殖和分化能力影響不同，細(xì)胞的觀察生長(zhǎng)速度規(guī)律與MTT 檢測(cè)值規(guī)律以及ALP 值規(guī)律基本一致，提示了該實(shí)驗(yàn)中不同濃度的依普黃酮對(duì)細(xì)胞增殖分化能力的影響有一定的規(guī)律，隨著依普黃酮濃度的增加，對(duì)成骨細(xì)胞增殖分化的促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)，然后隨著藥物濃度的增加，這種促進(jìn)作用減弱，其中10-8M 對(duì)細(xì)胞的作用最大，從而為依普黃酮口腔醫(yī)學(xué)上應(yīng)用提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。對(duì)于依普黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松成骨細(xì)胞作用先增加后減弱的原因，可能是很多藥物都有自身合適的治療劑量，超過(guò)這個(gè)治療劑量后，藥物的作用可能出現(xiàn)質(zhì)的變化，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不同程度的毒性或不良反應(yīng)，對(duì)于骨質(zhì)疏松成骨細(xì)胞來(lái)說(shuō)，在本研究的研究藥物劑量中，10-8M 是起到最大作用效果的一個(gè)安全藥物濃度。但是有學(xué)者通過(guò)對(duì)M3T3 成骨細(xì)胞系的研究發(fā)現(xiàn)依普黃酮在10-10M 濃度時(shí)起到最大的促增殖分化的作用[16]。有差別的原因主要是因?yàn)樗捎玫募?xì)胞不同，也從側(cè)面提示了對(duì)骨質(zhì)疏松頜骨成骨細(xì)胞培養(yǎng)和研究的必要性。

當(dāng)然，對(duì)于骨質(zhì)疏松癥在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究仍然需要更加深入，從而為口腔醫(yī)學(xué)疾病的防治起到一定的作用。