于 淼 李生嬌 艾澤馨 吳洋歐 李 家

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是最常見的骨骼疾病，由于常伴發(fā)骨折，給患者生活帶來極大的影響，已然成為重要公共健康問題[1]。由于骨質(zhì)疏松的發(fā)生，骨量的降低及骨結(jié)合能力下降，都將影響種植體的初期穩(wěn)定性，極大影響種植手術(shù)預(yù)后[2]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)microRNA 在骨代謝中起重要作用，已經(jīng)逐漸成為骨代謝疾病機(jī)制研究的熱點(diǎn)之一[3]。因此，深入探究microRNA 與OP 的關(guān)系，有望對OP 發(fā)病機(jī)制的研究和治療提供新的思路。

OP 的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，既往研究表明氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)是引發(fā)OP 的重要因素之一[4，5]。OS 是由于生成過剩的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，無法通過內(nèi)源性抗氧化劑清除，超出正常生理閾值，激發(fā)一系列細(xì)胞的毒性反應(yīng)，從而進(jìn)一步使組織損傷的過程[6]?；钚匝跽T導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)引起骨穩(wěn)態(tài)的改變，使骨吸收增加、骨形成減少，從而導(dǎo)致OP 的發(fā)生。此時(shí)成骨細(xì)胞功能減弱[7]，有學(xué)者報(bào)道，miR-320a 能增加OS 水平，并降低成骨細(xì)胞功能，促進(jìn)了OP 的發(fā)生[8]。Liu 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，ROS 的減少可以增加骨量，并預(yù)防卵巢去除后引起的OP。目前在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，調(diào)節(jié)OP 的microRNA 的研究報(bào)道仍較少，有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)。

本研究將通過GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫獲取臨床OP 病人樣本的芯片，分析差異表達(dá)的microRNA，利用miRTarBase 和miRDB 進(jìn)行靶基因預(yù)測，DAVID(TheDatabasefor Annotation，Visualization and Integrated Discovery)數(shù)據(jù)庫對靶基因進(jìn)行基因本體(Gene Ontology，GO)分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析。在此基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建小鼠骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型及處于氧化應(yīng)激狀態(tài)的成骨細(xì)胞，對氧化應(yīng)激條件下OP 相關(guān)的microRNA 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1.材料和方法

1.1 試劑和儀器 MC3T3-E1(武漢普諾賽生命科技有限公司，中國)；胎牛血清(biological industrial，以色列)；1%青霉素和鏈霉素，α-MEM培養(yǎng)基(HyClone，美國)；增強(qiáng)型CCK8 試劑盒(北京博奧森生物科技有限公司，中國)；TRIzol，PrimeScript1st StrandcDNA 合成試劑盒(TaKaRa，日本);Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche，美國)；SYBR Green PCR master mix(上海翊圣生物科技有限公司，中國)；基因引物(上海生工生物科技有限公司，中國)；microRNA 引物(廣州銳博生物科技有限公司，中國)；μCT(Scanco50，瑞士)；LightCycler 96(Roche，美國)。

1.2 microRNA 芯片數(shù)據(jù)獲取 從GEO 數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/ geo)獲取芯片數(shù)據(jù)集，篩選標(biāo)準(zhǔn)：(1)數(shù)據(jù)為microRNA 芯片；(2)人的骨質(zhì)疏松與非骨質(zhì)疏松樣本；(3)樣本數(shù)大于5?；谝陨蠘?biāo)準(zhǔn)，將GSE74209 納入研究。

1.3 數(shù)據(jù)處理與microRNA 篩選 GEO2R(https：// www.ncbi.nlm.nih.gov/ geo/ geo2r/)是基于R 語言limma 包分析差異microRNA，利用GEO2R 在線分析芯片GSE74209，篩選差異表達(dá)的microRNA。差異表達(dá)的microRNA 的閾值設(shè)置為log(fold change)絕對值大于2，P.adjust小于0.05。差異分析結(jié)果繪制microRNA 差異表達(dá)量熱圖。

1.4 microRNA 的靶基因預(yù)測利用 miRTar Base(http:// mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/ php/index.php)和miRDB(http:// www.mirdb.org/)預(yù)測靶基因并取交集，作為最終靶基因。

1.5 基因功能富集分析及通路分析 利用DAVID6.7(https:// david.ncifcrf.gov/)網(wǎng)站，輸入靶基因，選擇功能注釋工具，進(jìn)行GO 分析和KEGG 通路分析。

1.6 骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型構(gòu)建及micro-CT 分析采用雙側(cè)卵巢切除法(Ovariectomy，OVX)制備骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型，選擇8 周的雌鼠(C57BL/ 6J)共10 只，分為OVX 組和SHAM 組，每組各5 只，注射0.3%的戊巴比妥鈉(50mg/ kg)，固定，消毒，打開腹腔找到卵巢，切除雙側(cè)卵巢及其周圍的脂肪組織，拉攏縫合并消毒。SHAM 組僅切除卵巢周圍脂肪組織。取小鼠左側(cè)股骨，采用micro-CT 進(jìn)行掃描，在70kV，114μA，體素為14μm 的條件下獲取股骨圖像，并分析生長板下方100 層圖像，得到骨小梁三維重建圖，并進(jìn)行骨小梁定量分析。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)及氧化應(yīng)激處理 在α-MEM培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清，1%青霉素和鏈霉素，配置MC3T3-E1 培養(yǎng)液。在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3d 更換1 次培養(yǎng)液，待細(xì)胞密度達(dá)到80～90%時(shí)，1 ∶2～1 ∶4 傳代。使用MC3T3-E1 培養(yǎng)液配制過氧化氫梯度處理液，終濃 度 為100、200、300、400、500、600、700、800μmol/ L，每組濃度設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。以3000 個(gè)細(xì)胞/ 孔的密度，將MC3T3-E1 細(xì)胞系接種于96孔板中，細(xì)胞貼壁后過氧化氫處理液處理4h，加入CCK8 工作液，2h 后檢測各孔的光密度值(OD450)，篩選構(gòu)建氧化應(yīng)激的最優(yōu)濃度。在氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組為過氧化氫最優(yōu)濃度處理組，對照組為無過氧化氫處理組，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。

1.8 熒光定量PCR 提取小鼠股骨骨干部分和過氧化氫處理的細(xì)胞的RNA，全程置于冰上操作，使用Trizol 裂解方法提取總RNA，使用Prime Script1st StrandcDNA 試劑盒逆轉(zhuǎn)總RNA，同時(shí)使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 逆轉(zhuǎn)microRNA，得到的cDNA 放到-20℃保存。qPCR Sybr Green Master Mix 用于PCR 擴(kuò)增，加入各基因擴(kuò)增引物，選擇GAPDH 作為內(nèi)源性對照基因，U6 作為內(nèi)源性對照microRNA，設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，并在LightCycler 96 上進(jìn)行qPCR，使用自帶軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)?；蛞镄蛄幸姳?，microRNA 引物購自銳博生物科技有限公司。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 20.0 對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用t 檢驗(yàn)法比較兩組之間的差異，單因素方差分析比較組間差異，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 篩選差異表達(dá)microRNA 通過GEO2R在線分析，并結(jié)合文獻(xiàn)[10]去掉一組離群樣本GSM 1914630，分析出26 個(gè)有表達(dá)差異的microRNA，并繪制這26 個(gè)microRNA 差異表達(dá)量熱圖，熱圖顯示了microRNAs 和樣本的雙向?qū)哟尉垲惤Y(jié)果，右側(cè)圖例顏色標(biāo)度顯示了microRNA 在不同樣品中的相對表達(dá)水平，見圖1。

2.2 靶基因預(yù)測及其功能分析 從miRDB 數(shù)據(jù)庫中共得到2873 個(gè)靶基因，miRTarBase 數(shù)據(jù)庫共獲得4238 個(gè)靶基因，取交集共883 個(gè)，見圖2A。靶基因通路主要富集于癌癥通路、黏著斑、MAPK 信號通路、激動(dòng)蛋白骨架調(diào)節(jié)、趨化因子信號通路等，見圖2B。靶基因功能富集分析分為三部分，生物進(jìn)程體現(xiàn)在高分子代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、磷酸代謝過程、蛋白質(zhì)氨基酸磷酸化、核苷酸代謝過程等；細(xì)胞組分體現(xiàn)在細(xì)胞器內(nèi)腔及膜，細(xì)胞溶質(zhì)，高爾基體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核質(zhì)等；分子功能體現(xiàn)在嘌呤核苷酸結(jié)合、DNA 結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性、ATP 結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白激酶結(jié)合等，見圖2C。

表1 用于qPCR基因的引物序列

圖2 microRNA 的靶基因預(yù)測及其功能富集分析

2.3 OVX 小鼠氧化應(yīng)激水平檢測 與SHAM小鼠相比，OVX 小鼠股骨的骨密度(Bone mineral density，BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(Bone volume/ total bone volume，BV/ TV)、骨小梁數(shù)量(Trabecular number，Tb.N)顯著降低，骨小梁分離度(Trabecular separation，Tb.Sp)顯著升高(圖3B)，提示骨量丟失，表明去卵巢小鼠的骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型成功建立。同時(shí)，提取小鼠股骨骨干部分總RNA，qPCR結(jié)果表明氧化應(yīng)激的標(biāo)志基因血紅素加氧酶(heme oxygenase-1，HO-1)、核因子E2 相關(guān)因子2(nuclear factor-E2 related factor 2，Nrf2)、過氧化氫酶(catalase，CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶3(glutathione peroxidase 3，GPx3)均顯著上調(diào)，如圖3C，提示在骨質(zhì)疏松中氧化應(yīng)激水平提高。

2.4 OVX 小鼠中microRNA 變化 通過miRBase(http:// www.mirbase.org/)數(shù)據(jù)庫，對26 個(gè)差異microRNA 逐一比對，挑選在鼠中與人有同源性的microRNA 并結(jié)合文獻(xiàn)，共篩選出6 個(gè)microRNA，分別為miR-491-3p、miR-22-3p、miR-223-3p、miR-32-3p、miR-30c-1-3p、miR-26b-5p。與SHAM 組相比，OVX 組中miR-491-3p、miR-22-3p、miR-223-3p、miR-32-3p、miR-30c-1-3p 和miR-26b-5p 較SHAM 組 均表達(dá)降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見圖4。

2.5 MC3T3-E1 細(xì)胞氧化應(yīng)激水平檢測及microRNA 的變化 為探討合適的過氧化氫處理濃度，設(shè)置濃度梯度分別為0，100，200，300，400，500，600，700，800μmol/ L，CCK8 法測定細(xì)胞活力。結(jié)果顯示(圖5A)隨著過氧化氫濃度上升，吸光度逐漸下降，與對照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＜0.01，且300μmol/ L 到400μmol/ L 下降明顯，因此300μmol/ L 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。

MC3T3-E1 細(xì)胞為前成骨細(xì)胞系，用以研究體外成骨細(xì)胞在氧化應(yīng)激下microRNA 的變化。過氧化氫處理4h 后，HO-1、Nrf2 的表達(dá)顯著升高，見圖5B，表明在體外成骨細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。同時(shí)檢測6 個(gè)microRNA 的表達(dá)，見圖5C，miR-30c-1-3p 和miR-32-3p 表達(dá)下降，miR-223-3p 表達(dá)上升，而miR-26b-5p、miR-491-3p 和miR-22-3p 表達(dá)無差異。

圖3 OVX 小鼠氧化應(yīng)激水平檢測

圖4 OVX 小鼠中microRNA 變化

圖5 MC3T3-E1 細(xì)胞在過氧化氫處理后氧化應(yīng)激水平改變及microRNA 的變化

3.討論

近年來，microRNA 在骨代謝中發(fā)揮了重要作用，有研究表明miR-214 通過靶向ATF4 調(diào)節(jié)骨形成[11]，miR-2861 表達(dá)降低，可降低Runx2 蛋白表達(dá)，抑制骨形成[12]。我們將通過microRNA芯片分析，挖掘在骨質(zhì)疏松起調(diào)控作用的microRNA。本研究通過GEO 數(shù)據(jù)庫，獲取臨床骨質(zhì)疏松患者芯片數(shù)據(jù)GSE74209，GEO2R 分析得到26 個(gè)差異microRNA。經(jīng)miRDB 和miRTarBase 數(shù)據(jù)庫預(yù)測得到883 個(gè)靶基因，輸入DAVID 數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行基因功能的富集分析和通路分析。KEGG 通路主要富集于癌癥通路、黏著斑、MAPK 通路、激動(dòng)蛋白骨架調(diào)節(jié)、趨化因子信號通路等。以往的研究證實(shí)，上述通路在骨改建及骨質(zhì)疏松進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[4]。

為了進(jìn)一步研究差異microRNA 在骨質(zhì)疏松中的作用，本研究在小鼠體內(nèi)構(gòu)建骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型。Micro-CT 分析結(jié)果表明OVX 小鼠較SHAM小鼠骨量丟失明顯。qPCR 檢測動(dòng)物模型的氧化應(yīng)激標(biāo)志基因HO-1、Nrf2、CAT 和GPx3，OVX小鼠較SHAM 小鼠均有明顯上升。其中CAT 和GPx3 為抗氧化酶以清除過多的ROS[13]。HO-1 是Ⅱ相解毒酶之一，為抗氧化還原蛋白[14]。Nrf2 可以與抗氧化反應(yīng)元件ARE 結(jié)合，激活HO-1 并清除ROS[15]。上述四個(gè)基因表達(dá)上升，表明在骨質(zhì)疏松中的確產(chǎn)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)。我們又通過miRBase 數(shù)據(jù)庫比對與鼠同源的microRNA，從26 個(gè)差異表達(dá)microRNA 的篩選出miR-491-3p、miR-22-3p、miR-223-3p、miR-32-3p、miR-30c-1-3p、miR-26b-5p，PCR 檢測其表達(dá)，與SHAM 組比，OVX 組表達(dá)均表達(dá)下降。本研究結(jié)果表明，這6 個(gè)microRNA 可能通過其靶基因參與骨質(zhì)疏松的調(diào)控。

為進(jìn)一步探究這6 個(gè)microRNA 在骨質(zhì)疏松中的作用，我們使用過氧化氫處理成骨細(xì)胞使處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，過氧化氫處理后，成骨細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激標(biāo)志基因HO-1 和Nrf2 表達(dá)均升高。同時(shí)，PCR 檢測了6 個(gè)差異microRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-30c-1-3p 和miR-32-3p 表達(dá)下降，結(jié)合芯片數(shù)據(jù)，miR-32-3p 表達(dá)與芯片結(jié)果一致。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-30c-1-3p 能通過靶基因調(diào)控癌細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的增殖及分化[16，17]。MiR-32-3p 通過調(diào)控TGF-β 信號通路中SMAD2，SMAD4 和MAPK1 的表達(dá)[18]，參與慢性鼻竇炎伴鼻息肉的發(fā)生。關(guān)于miR-32-3p 的骨代謝研究報(bào)道較少，我們的研究提示，miR-32-3p 可能通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，影響骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展，其作用機(jī)制仍有待深入研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型中miR-491-3p、miR-22-3p 和miR-26b-5p 表達(dá)降低，而在氧化應(yīng)激狀態(tài)下的成骨細(xì)胞中的表達(dá)沒有差異。有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-22-3p 通過靶向HDAC6 調(diào)節(jié)人脂肪組織源性間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化和成脂分化[19]，miR-26b-5p 通過靶向BMP2 調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[20]。因此，我們推測，miR-22-3p 和miR-26b-5p 沒有通過氧化應(yīng)激途徑調(diào)控成骨細(xì)胞功能，這兩個(gè)microRNA 可能通過調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，在骨質(zhì)疏松發(fā)揮作用。雖然miR-223-3p 在OVX 小鼠體內(nèi)表達(dá)降低，但在氧化應(yīng)激狀態(tài)下的成骨細(xì)胞中表達(dá)升高，有研究表明miR-223-3p 能通過靶向KLF15 來防御心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激刺激[21]，關(guān)于miR-223-3p 在骨質(zhì)疏松中的作用仍有待深入研究。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)篩選得到與骨質(zhì)疏松相關(guān)的microRNA，并對靶基因進(jìn)行基因功能富集分析及通路分析，同時(shí)在骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型和氧化應(yīng)激狀態(tài)下的成骨細(xì)胞中進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果提示miR-32-3p 可能通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，在骨質(zhì)疏松中發(fā)揮重要作用。這些分析結(jié)果為骨質(zhì)疏松的的病因研究及防治提供新的方向，也為其深入探究其發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。