呂新河

(南京旅游職業(yè)學(xué)院,南京 211100)

海英菜，嫩苗俗稱“狼尾巴條”。海英菜屬一年生草本植物。海英菜的嫩莖葉食用方式比較豐富，同時(shí)海英菜便于貯藏和運(yùn)輸，因此海英菜擁有良好的開發(fā)前景[1-3]。隨著社會(huì)的發(fā)展，人們?nèi)遮呏匾暋熬G色食品”，講求天然。目前海英菜已成為沿海地區(qū)較有名氣的特色佐餐小菜和調(diào)味品。

近年來，對(duì)于海英菜的研究資料相對(duì)較少，尤其是全面性地研究海英菜的抗氧化能力[4-6]。現(xiàn)代生物學(xué)認(rèn)為活性氧和體內(nèi)自由基增多是促進(jìn)衰老進(jìn)程的主要原因，目前國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)天然提取物體外抗氧化的研究大多是從自由基的清除角度來進(jìn)行論證。因此，本試驗(yàn)使用自由基DPPH·、過氧化氫H2O2體系、羥自由基·OH體系、脂質(zhì)過氧化抑制能力、還原能力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)海英菜的體外抗氧化活性及細(xì)胞學(xué)免疫活性進(jìn)行研究，并對(duì)其體外抗氧化活性的變化趨勢(shì)進(jìn)行分析，為充分利用海英菜潛在的天然抗氧化劑開發(fā)功能性食品、調(diào)味品提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

海英菜購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，冷凍干燥，然后用萬能粉碎機(jī)磨成粉末，放在干燥器中備用。

1.2 主要試劑與儀器設(shè)備

1.2.1 主要試劑

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、TCA、BHT、三氯化鐵、雙氧水、氫氧化鈉、甲醇、乙酸、鄰苯三酚、Tris、鹽酸、DPPH、乙酸乙酯、硫酸亞鐵、苯酚、濃硫酸、85%磷酸、水楊酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、無水碳酸鈉：以上試劑均為分析純。

1.2.2 儀器設(shè)備

FA1256B型電子分析天平 浙江飛衡儀器公司；738GA-100型紫外可見分光光度計(jì) 上海精密儀器公司；ULT1569-6-S型超低溫冰箱 美國(guó)Revco公司；ALZAK 1-3BA Plus凍干機(jī) 德國(guó)Marin Christ公司；L8-3KR低溫離心機(jī) 上海三利儀器公司；LA纖維超濾裝置 上海博納設(shè)備公司；高壓滅菌鍋 山東博科公司；SCB恒溫水浴鍋 廣州耀特儀器公司；FSH-3B組織勻漿器 蘇州億能儀器公司。

1.3 海英菜乙醇提取物的制備

稱取一定量的海英菜粉末，按照1∶60的料液比混合，置于55 ℃恒溫水浴鍋中磁力攪拌浸提4 h，抽濾得上清液，蒸發(fā)濃縮后，置于鋁盒中，冷卻至室溫后放入-75 ℃超低溫冰箱中預(yù)凍，冷凍干燥，得到乙醇提取物，稱重，置于干燥器皿中待用。

1.4 海英菜乙醇提取物體外抗氧化活性研究

1.4.1 過氧化氫清除率的測(cè)定

測(cè)定參照Mu等[7]的方法并加以修改，實(shí)試驗(yàn)步驟如下：將提取物干燥粉末溶于蒸餾水中，配制成5種不同濃度的受試物：0.1，0.2，0.4，0.8，1 mg/mL。用pH為7.4的磷酸鹽緩沖液配制10 mmol/L的過氧化氫溶液，取受試物2 mL與過氧化氫2 mL，混勻，磷酸緩沖液調(diào)零，在248 nm下測(cè)定吸光度，記作A1。取4 mL過氧化氫，在248 nm下測(cè)吸光度，記作A0。取2 mL受試物與2 mL磷酸緩沖液混勻，在248 nm下測(cè)吸光度，記作A2。按照下式計(jì)算清除率，以Vc作為對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3次，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100%。

1.4.2 羥基自由基清除率的測(cè)定

測(cè)定參照Ahmad等[8]的方法并加以修改，試驗(yàn)步驟如下：將提取物干燥粉末溶于蒸餾水中，配制成5種不同濃度的受試物：0.1，0.2，0.8，1，4 mg/mL。取1 mL 9 mmol/L硫酸亞鐵溶液、1 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇、1 mL受試物，再加入1 mL 8.8 mmol/L過氧化氫啟動(dòng)整個(gè)反應(yīng)，混勻，37 ℃水浴反應(yīng)30 min，在510 nm下測(cè)吸光度，記作A1。以蒸餾水代替過氧化氫，在510 nm下測(cè)吸光度，記作A2。以蒸餾水代替受試物，加入過氧化氫啟動(dòng)整個(gè)反應(yīng)，在510 nm下測(cè)定吸光度，記作A0。按照下式計(jì)算清除率，以Vc作為對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3次，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100%。

1.4.3 DPPH·清除率的測(cè)定

測(cè)定參考Martha等[9]的方法并稍作修改，試驗(yàn)步驟：將制得的樣品用蒸餾水調(diào)制為以下不同質(zhì)量濃度梯度：0.1，0.2，0.4，0.8，1.0 mg/mL。量取2.0 mL調(diào)配好的試樣溶液與2.0 mL DPPH·乙醇溶液混合，常溫下反應(yīng)0.5 h，測(cè)定517 nm處的吸光值，記作Ai。取2 mL DPPH·乙醇溶液與2.0 mL無水乙醇重復(fù)以上步驟，測(cè)定值記作Ac。取2.0 mL試樣溶液與2.0 mL無水乙醇溶液重復(fù)以上步驟，測(cè)定值記作Aj。按照下式計(jì)算清除率，以Vc作為對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3次，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%。

1.4.4 脂質(zhì)過氧化抑制率的測(cè)定

抗脂質(zhì)過氧化的測(cè)定主要參考Karigidi等[10]的方法并稍作修改，試驗(yàn)步驟如下：將制得的樣品用蒸餾水調(diào)制為以下不同質(zhì)量濃度梯度：0.1，0.2，0.4，0.8，1 mg/mL。取1.2 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4)，然后依次加入2 mL不同濃度梯度的樣品，0.4 mL稀釋蛋黃液(用磷酸鹽緩沖液以1∶50稀釋)以及0.4 mL FeSO4(25 mmol/L)，混合均勻后在37 ℃水浴振蕩20 min。水浴結(jié)束后加入2 mL 10%三氯乙酸(TCA)，搖勻后室溫靜置10 min，10000 g離心10 min，取2 mL上清液，加入2 mL 0.8% TBA混勻，沸水浴15 min，待冷卻后在532 nm處測(cè)定吸光值，記作A1。以蒸餾水代替受試物進(jìn)行上述相同操作，在532 nm處測(cè)定吸光值，記作A0。以蒸餾水代替TBA溶液進(jìn)行上述相同操作，在532 nm處測(cè)定吸光值，記作A2。按照下式計(jì)算清除率，以Vc作為對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3次，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

抑制率(%)=(1-( A1-A2)/A0)×100%。

1.5 海英菜乙醇提取物對(duì)H2O2損傷后小鼠巨噬細(xì)胞的保護(hù)作用

1.5.1 小鼠巨噬細(xì)胞的提取

小鼠巨噬細(xì)胞的提取主要參考Anuradha等[11-13]的方法并稍作修改。將7周齡C57雌性小鼠脫頸處死，置于70%乙醇中浸泡2 min。在無菌操作臺(tái)內(nèi)將小鼠固定在消毒后的泡沫板上，用滅菌的剪刀和鑷子剝離表皮(注意不要破壞腹腔粘膜)。用酒精棉球輕輕擦拭腹膜，再用滅菌后的50 mL注射器吸取1640培養(yǎng)液15 mL緩緩注入腹腔，然后吸出，反復(fù)操作10次，將吸出液體注入15 mL滅菌離心管中，用封口膠封口，在4 ℃，1500 r/min條件下離心5 min，離心后在無菌操作臺(tái)中，倒出上清液，用滅菌后的PBS溶液洗滌1次，轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，封口，在4 ℃，1500 r/min條件下離心5 min，以上清洗操作重復(fù)3次。清洗結(jié)束后用1640培養(yǎng)液重懸備用。

1.5.2 抗氧化指標(biāo)的測(cè)定

抗氧化指標(biāo)的測(cè)定主要參考Shuji等[14-16]的方法并稍作修改。將96孔培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出，培養(yǎng)液分別按對(duì)應(yīng)的順序轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，封口，在4 ℃，1500 r/min條件下離心5 min，棄去上清液。用PBS緩沖液懸浮，經(jīng)超生粉碎細(xì)胞，3000 r/min離心15 min，取上清液制成勻漿。按照試劑盒方法測(cè)定超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性以及丙二醛(MDA)含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)分析運(yùn)用SPSS 19.0軟件。運(yùn)用Microsoft Excel 2003軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 海英菜乙醇提取物的體外抗氧化活性研究

2.1.1 海英菜乙醇提取物對(duì)過氧化氫清除率的影響

圖1 海英菜乙醇提取物對(duì)H2O2清除率的影響Fig.1 Effect of ethanol extract of Suaeda glauca Bunge on the scavenging rate of H2O2

由圖1可知，同一樣品在不同濃度下，在濃度范圍內(nèi)，海英菜乙醇提取物對(duì)過氧化氫都有一定的清除能力，海英菜乙醇提取物對(duì)過氧化氫的清除率隨著樣品濃度的增大而升高。當(dāng)濃度達(dá)到1 mg/mL時(shí)，海英菜乙醇提取物的清除率最大值為91.2%。而Vc的清除率達(dá)到了93.8%。在0.1～0.2 mg/mL濃度范圍內(nèi)，海英菜乙醇提取物對(duì)過氧化氫的清除能力顯著提高。在0.4～0.8 mg/mL濃度范圍內(nèi)，海英菜乙醇提取物對(duì)過氧化氫清除能力的變化并不明顯。

2.1.2 海英菜乙醇提取物對(duì)DPPH·自由基清除率的影響

圖2 海英菜乙醇提取物對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of ethanol extract of Suaeda glauca Bunge on the scavenging rate of DPPH free radical

由圖2可知，同一樣品在不同濃度下，樣品對(duì)DPPH·的清除率隨濃度的升高而增加。并且隨著樣品濃度的增加，海英菜乙醇提取物的清除率也有顯著性差異(P<0.05)。然而Vc隨樣品濃度增加所表現(xiàn)出的清除能力的差異性不顯著(P>0.05)。在0.1～0.2 mg/mL濃度范圍內(nèi)，海英菜乙醇提取物對(duì)DPPH·的清除能力顯著提高。在0.4～0.8 mg/mL濃度范圍內(nèi)，海英菜乙醇提取物對(duì)DPPH·清除能力的變化不明顯。在濃度范圍內(nèi)，當(dāng)濃度達(dá)到1 mg/mL時(shí)，海英菜乙醇提取物對(duì)DPPH·的清除能力最大，為86.7%。當(dāng)濃度達(dá)到0.1 mg/mL時(shí)，海英菜乙醇提取物對(duì)DPPH·的清除能力最小，為48.52%。

2.1.3 海英菜乙醇提取物對(duì)脂質(zhì)過氧化抑制率的影響

海英菜乙醇提取物對(duì)脂質(zhì)過氧化抑制率的影響見圖3。

圖3 海英菜乙醇提取物對(duì)脂質(zhì)過氧化抑制率的影響Fig.3 Effect of ethanol extract of Suaeda glauca Bunge on the inhibition rate of lipid peroxidation

由圖3可知，同一樣品在不同濃度時(shí)，海英菜乙醇提取物對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑制能力都隨著濃度的增加而增強(qiáng)。海英菜乙醇提取物在濃度超過0.1 mg/mL以及不超過0.8 mg/mL時(shí)，所表現(xiàn)出的抑制能力具有較顯著的差異性(P<0.05)，而濃度在0.8～1.0 mg/mL之間，所表現(xiàn)出的抑制能力表現(xiàn)出的差異性則不顯著(P>0.05)。然而，Vc的還原能力隨濃度變化所產(chǎn)生的差異不顯著(P>0.05)。在0.1～0.8 mg/mL濃度范圍內(nèi)，海英菜乙醇提取物對(duì)脂質(zhì)過氧化抑制率顯著提高。在0.8～1 mg/mL濃度范圍內(nèi)，海英菜乙醇提取物對(duì)脂質(zhì)過氧化抑制率的變化不明顯。在濃度范圍內(nèi)，當(dāng)濃度達(dá)到1 mg/mL時(shí)，海英菜乙醇提取物對(duì)脂質(zhì)過氧化抑制率最大，為87.88%。當(dāng)濃度達(dá)到0.1 mg/mL時(shí)，海英菜乙醇提取物對(duì)脂質(zhì)過氧化抑制率最小，為7.38%。

2.2 海英菜乙醇提取物對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的保護(hù)作用

2.2.1 海英菜乙醇提取物對(duì)H2O2損傷后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞SOD活性的影響

海英菜乙醇提取物對(duì)H2O2損傷后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞SOD活性的影響見圖4。

圖4 海英菜乙醇提取物對(duì)H2O2損傷后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞SOD活性的影響Fig.4 Effect of ethanol extract of Suaeda glauca Bunge on SOD activity of mouse peritoneal macrophages after H2O2 injury

由圖4可知，H2O2損傷組的SOD活性相對(duì)于正常組有顯著降低(P<0.05)。在提取物濃度為200,400,800 mg/mL時(shí)，細(xì)胞內(nèi)SOD活性與損傷組相比有顯著增高，并且隨著濃度的提高，變化越顯著(P<0.05)。當(dāng)提取物濃度達(dá)到800 mg/mL時(shí)，SOD活性與正常組相比存在顯著的差距，可能是提取物對(duì)SOD活性的恢復(fù)達(dá)不到正常的活性值(P<0.05)。結(jié)果表明，海英菜乙醇提取物對(duì)H2O2損傷后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞SOD活性有一定的恢復(fù)作用。

2.2.2 海英菜乙醇提取物對(duì)H2O2損傷后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞GSH-Px活性的影響

海英菜乙醇提取物對(duì)H2O2損傷后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞GSH-Px活性的影響見圖5。

圖5 海英菜乙醇提取物對(duì)H2O2損傷后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞GSH-Px活性的影響Fig.5 Effect of ethanol extract of Suaeda glauca Bunge on GSH-Px activity of mouse peritoneal macrophages after H2O2 injury

由圖5可知，H2O2損傷組的GSH-Px活性相對(duì)于正常組顯著降低(P<0.05)。當(dāng)提取物在200,400,800 mg/mL濃度時(shí)，相對(duì)于損傷組細(xì)胞內(nèi)GSH-Px的活性顯著增高，并且濃度越高，GSH-Px的活性越大(P<0.05)。當(dāng)提取物濃度在400 mg/mL時(shí)，與200,800 mg/mL均無顯著差異，可能是因?yàn)樘崛∥餄舛炔粔颍瑢?duì)GSH-Px活性的影響不大。結(jié)果表明,海英菜乙醇提取物對(duì)H2O2損傷后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞GSH-Px活性有一定的恢復(fù)作用且效果顯著。

2.2.3 海英菜乙醇提取物對(duì)H2O2損傷后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞MDA含量的影響

海英菜乙醇提取物對(duì)H2O2損傷后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞MDA含量的影響見圖6。

圖6 海英菜乙醇提取物對(duì)H2O2損傷后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞MDA含量的影響Fig.6 Effect of ethanol extract of Suaeda glauca Bunge on MDA content of mouse peritoneal macrophages after H2O2 injury

由圖6可知，H2O2損傷后細(xì)胞內(nèi)MDA含量相對(duì)于正常組顯著升高(P<0.05)。當(dāng)提取物濃度在200,400,800 mg/mL時(shí)，隨著濃度增大，細(xì)胞內(nèi)MDA含量相對(duì)于損傷組顯著降低(P<0.05)。當(dāng)提取物濃度在800 mg/mL時(shí)，細(xì)胞內(nèi)MDA含量相對(duì)正常組水平有顯著差異(P<0.05)，可能是提取物還沒有達(dá)到最適濃度。結(jié)果表明，海英菜乙醇提取物對(duì)H2O2損傷后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞MDA含量有明顯的降低作用。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)用乙醇從海英菜中提取出抗氧化物質(zhì)，通過對(duì)自由基的清除能力來對(duì)海英菜的體外抗氧化性進(jìn)行研究，得出以下結(jié)論。

試驗(yàn)結(jié)果表明海英菜乙醇提取物對(duì)H2O2有清除作用，隨著濃度的升高，且在高濃度時(shí)與Vc相近。海英菜乙醇提取物對(duì)DPPH·有一定清除作用，隨著濃度的增加而增加，但弱于Vc對(duì)DPPH·的清除作用，并且相差較大。海英菜乙醇提取物都具有一定的還原力，隨濃度的升高而變大。尤其在受試樣品低濃度時(shí)，海英菜乙醇提取物的還原力與Vc的還原力相差很大。不同受試劑量的海英菜乙醇提取物均有抑制脂質(zhì)過氧化的能力，且隨著濃度的升高而增強(qiáng)。在高濃度時(shí)，海英菜乙醇提取物的抑制能力與Vc相近。

海英菜乙醇提取物對(duì)H2O2損傷后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞SOD活性有一定的恢復(fù)作用。海英菜乙醇提取物對(duì)H2O2損傷后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞GSH-Px活性有一定的恢復(fù)作用且效果顯著。海英菜乙醇提取物對(duì)H2O2損傷后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞MDA含量有明顯的降低作用。

不同受試劑量的海英菜乙醇提取物均具有一定的抗氧化性，能夠很好地清除多種自由基，預(yù)防許多自由基引起的老化及相關(guān)疾病。此外，海英菜調(diào)味類小菜可作為潛在的天然抗氧化劑和食品、菜肴保鮮劑，為下一步的食品保鮮研究提供理論基礎(chǔ)。隨著食品技術(shù)應(yīng)用的發(fā)展，海英菜具有廣闊的開發(fā)和應(yīng)用前景。