燕平梅，王炫月，趙文婧

(1.太原師范學(xué)院 生物系，太原 030619;2.土壤消毒活化綠色產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟，太原 030619)

蔬菜極易富集硝酸鹽，硝酸鹽遠遠高于亞硝酸鹽的含量[1]。蔬菜發(fā)酵后亞硝酸鹽含量遠高于硝酸鹽[2]。前人通過大量的試驗證實了蔬菜發(fā)酵過程中的亞硝酸鹽由硝酸鹽轉(zhuǎn)化而來[3-10]。且發(fā)酵液與組織蔬菜中均會形成“亞硝峰”，分析了“亞硝峰”的形成是由泡菜表面的微生物通過硝酸還原酶作用將蔬菜中的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽。目前，泡菜中微生物研究采用純培養(yǎng)方法，此方法基于培養(yǎng)基培養(yǎng)，對微生物識別和描述，由于脫離了微生物生長的原位環(huán)境，影響微生物的研究結(jié)果[11]。非培養(yǎng)的方法可以真實反映特定環(huán)境中微生物多樣性，并且檢測極限低、檢測速度快、經(jīng)濟。非培養(yǎng)方法DGGE技術(shù)、克隆文庫分析法和高通量測序技術(shù)[12-16]等被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵甘藍微生物檢測中。基于高通量測序的宏基因組學(xué)方法較為全面和準確地反映泡菜生態(tài)系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)。而采用PCR-DGGE技術(shù)區(qū)別不同種群、群體變化和差異的信息、鑒定優(yōu)勢群落是其他技術(shù)無法比擬的。PCR-DGGE技術(shù)廣泛用于發(fā)酵食品微生物群落的研究，如韓國泡菜、麥芽威士酒、意大利香腸、發(fā)酵玉米團[17-21]。燕平梅等[22]用培養(yǎng)和PCR-ARDRA的非培養(yǎng)方法研究酸白菜制品的乳酸菌多樣性，結(jié)果表明非培養(yǎng)樣品的乳酸菌多樣性較培養(yǎng)方法豐富。付琳琳[23]以不同家庭制作的成熟期的泡菜液為材料，采用PCR-DGGE方法研究了泡菜液中乳酸菌多樣性，說明DGGE方法檢測優(yōu)勢菌群的優(yōu)點。本研究利用PCR-DGGE-克隆的非培養(yǎng)方法分析甘藍發(fā)酵過程中細菌、真菌、乳酸菌隨發(fā)酵時間變化而演變的規(guī)律。根據(jù)DGGE電泳圖譜中的相對含量(由凝膠成像系統(tǒng)的配套軟件Quantity-One計算強度)做出隨發(fā)酵時間的變化圖。并和NO2-含量隨發(fā)酵時間變化圖相比較，推測與NO2-形成、還原相關(guān)優(yōu)勢微生物的基因片段。探明蔬菜發(fā)酵過程中與“亞硝峰”形成和降解的微生物，為發(fā)酵蔬菜的安全化生產(chǎn)條件的控制提供了技術(shù)原理和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

泡菜所用的甘藍:購自沃爾瑪超市。細菌基因組DNA提取試劑盒和PCR所需試劑:天根時代生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR儀 Mastereycler Gradient公司；凝膠成像系統(tǒng)(DcodeTM) Bio-Rad公司；Nanodrop分光光度計。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵甘藍的制備和取樣

甘藍發(fā)酵：采用干凈滅菌的250 mL三角瓶為發(fā)酵容器，加入沖洗干凈和切分的白菜以及4%、6%、8%食鹽煮沸后冷卻的鹽水(菜∶鹽水為1∶2,m/V)，于20 ℃條件厭氧發(fā)酵。分別在第1，3，5，7，9，11，13天取發(fā)酵樣品。

1.3.2 發(fā)酵甘藍體系微生物DNA的提取

以試劑盒步驟提取基因組DNA，保存于4 ℃冰箱備用。

1.3.3 發(fā)酵甘藍微生物16S rDNA V3基因片段DGGE

16S rDNA序列V3片段擴增引物為通用引物。引物序列341f-GC和534r。PCR反應(yīng)體系 25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃ 30 s，48.8 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，72 ℃ 6 min，30個循環(huán)。

取 PCR產(chǎn)物20 μL進行DGGE實驗，上層膠濃度為 8%，變性膠濃度為30%～50%。在 1×TAE 緩沖液中，在200 V 60 ℃下電泳 5 h。電泳后采用SYBR Green對凝膠染色1 h?；厥仗禺愲娪編?，進一步擴增克隆測序，并進行序列分析。

1.3.4 18S rDNA片段DGGE

真菌的18S rDNA序列選用18sp2和18sp3。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 4 min，94 ℃ 30 s，43 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，72 ℃ 6 min，30個循環(huán)。

取 PCR 產(chǎn)物 20 μL進行 DGGE 分析，上層膠濃度為 8%，變性膠濃度為18%～35%。在 1×TAE 緩沖液中，在200 V 60 ℃下電泳 4.5 h。電泳后采用SYBR Green對凝膠染色1 h。回收特異電泳帶，進一步擴增克隆測序，并進行序列分析。

1.3.5 切膠回收

將DGGE凝膠上回收條帶膠條碾碎，加約40 μL去離子水于4 ℃過夜。以此DNA為模板進行再次PCR反應(yīng)。

1.3.6 16S rDNA V3片段的克隆測序

經(jīng)純化后的PCR產(chǎn)物與pGM-T Vector連接，連接操作參照pGM-T克隆試劑盒操作說明。轉(zhuǎn)化大腸桿菌后檢測，陽性克隆測序。

1.3.7 測定泡菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的方法

將不同樣品5 mL置于自動取樣器中，接通流路。按儀器工作條件基線調(diào)零，開始進樣并采集吸光度信號。測定條件：波長600 nm，參比波長460 nm，125 ℃,速率30樣/h。

2 結(jié)果與分析

2.1 4%食鹽濃度發(fā)酵甘藍亞硝酸鹽、硝酸鹽含量分析

發(fā)酵甘藍亞硝酸鹽和硝酸鹽含量變化趨勢一致，見圖1。發(fā)酵第4天達到最高峰值，第6天為最小值，第10天達到次高峰值。亞硝酸最高峰值為561.59 mg/mL，次高峰值為137.34 mg/mL，亞硝酸鹽濃度在5.65～561.59 mg/mL之間。發(fā)酵開始時硝酸鹽含量高達119.23 g/mL，發(fā)酵甘藍鹵中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量低，濃度范圍為0.18～2.26 mg/mL。

圖1 4%食鹽濃度發(fā)酵甘藍亞硝酸鹽和硝酸鹽含量變化Fig.1 Nitrite and nitrate content changes of fermented cabbage with 4% salt concentration

2.2 4%食鹽濃度發(fā)酵甘藍亞硝酸鹽形成、還原相關(guān)的微生物分析

發(fā)酵甘藍亞硝酸鹽和硝酸鹽含量變化與微生物的16S rDNA V3片段DGGE圖譜(見圖2中A)比對得出，E條帶發(fā)酵初有熒光強度，發(fā)酵第7天最強；B條帶從發(fā)酵開始到第5天前后亮度強，在后期(第13天)檢測到D條帶和G條帶，4 d消失，其與亞硝酸鹽最高峰、次高峰出現(xiàn)的時間一致，因此，推斷E條帶在發(fā)酵第7天熒光亮度最盛，與亞硝酸鹽低谷時間大致吻合。 條帶B(Pseudomonassp.)、條帶D(Pantoeadispersa)和條帶G(Staphylococcussciuri)和亞硝酸鹽形成相關(guān)；因此，推斷條帶E(Leuconostocgasicomitatum)是和亞硝酸鹽還原相關(guān)的微生物。

圖2 發(fā)酵甘藍微生物16S rDNA DGGE指紋圖譜Fig.2 16S rDNA DGGE fingerprint of microorganisms in fermented cabbage

發(fā)酵甘藍亞硝酸鹽和硝酸鹽含量變化與18S rDNA的DGGE圖譜(見圖3)對比，發(fā)酵開始有A條帶，熒光強度由弱變強，第9天未檢測到，與亞硝酸鹽高峰和低谷出現(xiàn)時間對應(yīng)，說明條帶A(Aeromonassobria)可能和亞硝酸鹽的形成有關(guān)。在發(fā)酵第5天檢測到C條帶，但很快消失，說明條帶C(Meyerozymaguilliermondii)與亞硝酸鹽形成有一定的關(guān)系，第13天檢測到B條帶，但之后未出現(xiàn)，說明條帶B(Candidasp.)與亞硝酸鹽還原有一定的關(guān)系。

圖3 發(fā)酵甘藍真菌18S rDNA DGGE指紋圖譜Fig.3 18S rDNA DGGE fingerprint of fungi in fermented cabbage

2.3 食鹽濃度6%的發(fā)酵甘藍亞硝酸鹽、硝酸鹽含量分析

圖4 6%食鹽濃度發(fā)酵甘藍亞硝酸鹽和硝酸鹽含量變化Fig.4 Nitrite and nitrate content changes of fermented cabbage with 6% salt concentration

由圖4可知，甘藍發(fā)酵中亞硝酸鹽含量在第1天為最高峰，為10.57 mg/mL，然后下降，第5天平穩(wěn)；硝酸鹽含量在第13天最高，為8.40 mg/mL；而鹵水中的亞硝酸鹽含量和硝酸鹽含量變化趨勢不明顯。

2.4 6%的食鹽發(fā)酵甘藍亞硝酸鹽形成、還原相關(guān)的微生物分析

發(fā)酵甘藍亞硝酸鹽和硝酸鹽含量變化與發(fā)酵甘藍微生物的16S rDNA V3片段DGGE圖譜(見圖2中B)比對得出，發(fā)酵開始檢測到G條帶，第5天檢測不到。發(fā)酵第13天時檢測到A條帶。G條帶熒光亮度與亞硝酸鹽含量趨于一致，說明G代表微生物(Enterobacteriaceaebacterium)與亞硝酸鹽濃度有相關(guān)性。A條帶為后期條帶，說明條帶A(Leuconostoccitreum)可能與亞硝酸鹽的還原有關(guān)。

發(fā)酵甘藍亞硝酸鹽和硝酸鹽含量變化與18S rDNA的DGGE圖譜(見圖3中B)對比，發(fā)酵開始檢測到A條帶，第3天未檢測到，A條帶與亞硝酸鹽峰值出現(xiàn)時間相一致，說明條帶A代表微生物(Leuconostocgasicomitatum)與亞硝酸鹽形成相關(guān)；發(fā)酵初期檢測到C條帶，第13天未檢測到，其與硝酸鹽變化規(guī)律相一致，說明條帶C(Pseudomonassp.)與亞硝酸鹽還原相關(guān)。條帶A代表微生物(Candidasaitoana)、條帶F代表微生物(Pichiasorbitophila)和條帶G代表微生物(Candidasp.)均是發(fā)酵后期(11 d后)出現(xiàn)的微生物，可能與硝酸鹽峰值出現(xiàn)有關(guān)。

2.5 8%食鹽濃度發(fā)酵甘藍亞硝酸鹽、硝酸鹽含量分析

圖5 8%食鹽濃度發(fā)酵甘藍亞硝酸鹽和硝酸鹽含量變化Fig.5 Nitrite and nitrate content changes of fermented cabbage with 8% salt concentration

由圖5可知，甘藍發(fā)酵初期硝酸鹽含量為最大值68.25 mg/mL，之后下降，第5天達到第二次高峰(30.42 mg/mL)；發(fā)酵甘藍亞硝酸鹽含量范圍在2.22～14.77 mg/mL，第11天達到最高值；發(fā)酵甘藍鹵水中亞硝酸鹽的含量第11天達到最高值40.95 mg/mL，硝酸鹽含在第11天出現(xiàn)峰值16.43 mg/mL，亞硝酸鹽峰值出現(xiàn)的時間較硝酸鹽晚。

2.6 與食鹽濃度8%的發(fā)酵甘藍亞硝酸鹽形成、還原相關(guān)的微生物分析

發(fā)酵甘藍亞硝酸鹽和硝酸鹽含量變化趨勢與發(fā)酵甘藍細菌 V3片段DGGE圖譜(見圖2中C)比對，條帶B(Serratiasp.)條帶C(Staphylococcussciuri)條帶D(Rahnellasp.)在甘藍發(fā)酵初期，第9天未檢測到，推測是硝酸還原菌，導(dǎo)致亞硝酸鹽于發(fā)酵第11天出現(xiàn)峰值。

發(fā)酵甘藍亞硝酸鹽和硝酸鹽含量變化與發(fā)酵甘藍微生物18S rDNA的DGGE圖譜(見圖3中C)對比，發(fā)酵第11天前后檢測到條帶B(Debaryomycesoccidentalis)和條帶C(Pichiasorbitophila)，推測這些微生物與亞硝酸鹽形成有關(guān)。

對與亞硝酸鹽形成還原相關(guān)的微生物總結(jié)見表1。

表1 與亞硝酸鹽形成還原相關(guān)的微生物序列比對結(jié)果Table 1 Microbial sequence alignment result related formation and reduction of nitrite

3 討論

前人研究報道發(fā)酵蔬菜亞硝酸鹽的形成是雜菌將蔬菜的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽[24]。郭曉紅等對甘藍乳酸發(fā)酵初期微生物區(qū)系的細菌進行分類并用純培養(yǎng)方法測定了它們的硝酸鹽還原反應(yīng)，結(jié)果表明，腸道細菌科、黃桿菌屬、假單胞菌屬、葡萄球菌屬細菌多為硝酸鹽還原反應(yīng)陽性。紀淑娟等[25]研究顯示革蘭氏陰性菌、腸道細菌和黃桿菌是影響“亞硝峰”形成的主要微生物。作者前期的研究認為“亞硝峰”的形成主要是由腸桿菌和假單孢菌的硝酸還原酶將甘藍中的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽。發(fā)酵白菜中“亞硝峰”形成時的優(yōu)勢菌經(jīng)鑒定為陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)。從上述研究結(jié)果得知引起亞硝酸鹽生成的菌為乳酸菌之外的腸桿菌、假單孢菌、黃桿菌屬和葡萄球菌屬。

本研究通過PCR-DGGE-克隆的非培養(yǎng)方法分析甘藍發(fā)酵過程中細菌、真菌隨發(fā)酵時間變化而演變的規(guī)律。根據(jù)DGGE電泳圖譜中的相對含量(由凝膠成像系統(tǒng)的配套軟件Quantity-One計算強度)做出隨發(fā)酵時間的變化圖。并和NO2-含量隨發(fā)酵時間變化圖相比較，推測與NO2-形成、還原相關(guān)優(yōu)勢微生物的基因片段。分析優(yōu)勢微生物變化與亞硝酸鹽含量變化的關(guān)系。從DGGE圖譜一些特異性條帶的出現(xiàn)與消失時間來看，與亞硝酸鹽含量的變化趨勢相關(guān)，通過分析電泳條帶測序得出:亞硝酸鹽形成的微生物有腸桿菌(Enterobacteriaceaebacterium)、泛菌(Pantoeadispersa)、假單胞菌(Pseudomonassp.)、畢赤酵母(Pichiasorbitophila)、松鼠葡萄球菌(Staphylococcussciuri)、德巴利氏酵母(Debaryomycesoccidentalis)。與亞硝酸鹽還原相關(guān)的微生物為檸檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)和明串珠菌(Leuconostoccitreumstrain)。研究結(jié)果與前人用純培養(yǎng)方法檢測的與亞硝酸鹽形成相關(guān)的微生物(腸桿菌、假單孢菌、黃桿菌屬和葡萄球菌屬)和與亞硝酸鹽還原相關(guān)的微生物(乳酸菌)一致，但非培養(yǎng)方法(PCR-DGGE-克隆方法)檢測到泛菌、假絲酵母、畢赤酵母、德巴利氏酵母與發(fā)酵甘藍亞硝酸鹽形成相關(guān)。將來進一步采用純培養(yǎng)和接種發(fā)酵的方法，研究優(yōu)勢菌與亞硝酸鹽形成、還原的關(guān)系。

4 小結(jié)

由本實驗研究結(jié)果可知，與亞硝酸鹽形成相關(guān)的微生物主要是假單胞菌(Pseudomonassp.)、腸桿菌(Enterobacteriaceaebacterium)、松鼠葡萄球菌(Staphylococcussciuri)、泛菌(Pantoeadispersa)、德巴利氏酵母(Debaryomycesoccidentalis)、假絲酵母(Candidasp.)及畢赤酵母(Pichiasorbitophila)微生物。與亞硝酸鹽還原相關(guān)的微生物為檸檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)、明串珠菌(Leuconostoccitreumstrain)。