馬艷莉，段哲，梁靜靜，李素萍，丁玉峰，劉亞瓊*

(1.南陽理工學(xué)院河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點實驗室，河南 南陽 473004； 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定 071000)

益生菌是通過改善宿主微生態(tài)環(huán)境，提高宿主健康水平的一類有益微生物。丁酸梭菌是近年來備受關(guān)注的有利于人體健康的微生物，研究表明，丁酸梭菌可以改善腸道菌群，提高人體免疫力，預(yù)防惡性腫瘤發(fā)生[1-3]，但其主要代謝產(chǎn)物丁酸通常呈現(xiàn)臭味，容易破壞食品風(fēng)味，導(dǎo)致丁酸梭菌不能廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)，然而，丁酸是青方腐乳的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)，對青方腐乳風(fēng)味有積極貢獻作用[4]，因此青方腐乳可作為丁酸梭菌的良好載體。乳酸菌是目前食品中廣泛應(yīng)用的益生菌[5,6]，研究表明，在腐乳后發(fā)酵過程中，乳酸菌對促進產(chǎn)品風(fēng)味起重要作用[7]。

腐乳作為傳統(tǒng)調(diào)味品，歷史悠久、營養(yǎng)豐富、滋味鮮美，但其含鹽量較高，且存在一些其他食用安全隱患[8]，限制了產(chǎn)品消費，阻礙了其工業(yè)化、國際化進程。腐乳生產(chǎn)使用較多食鹽的主要目的是抑制有害菌生長、控制酶活[9]，而丁酸梭菌和乳酸菌可以抑制有害菌生長，所以可考慮一定程度上代替食鹽用于生產(chǎn)腐乳。

益生菌共培養(yǎng)具有重要研究和應(yīng)用價值，可以產(chǎn)生很多純培養(yǎng)所不能達到的效果，已有文獻報道，益生菌共培養(yǎng)可明顯提升菌株的生理代謝能力和生物量，并產(chǎn)生高于純菌培養(yǎng)的抑菌能力等[10]。已有大量研究報道丁酸梭菌能夠促進腸道有益菌增殖、抑制致病菌生長[11,12]，但丁酸梭菌與乳酸菌共培養(yǎng)報道較少。

本研究在前期實驗發(fā)現(xiàn)青方腐乳富含丁酸及丁酸梭菌基礎(chǔ)上，使用亨蓋特厭氧法從青方腐乳中分離丁酸梭菌，進行分子生物學(xué)鑒定，并研究其與乳酸菌共培養(yǎng)特性，以期為益生菌在青方腐乳中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用乳酸菌為實驗室從腐乳中分離保存，命名為LB01；丁酸、乳酸標(biāo)準品：色譜純，購自Sigma公司；乙腈：色譜純，購自Dima公司；乳酸菌瓊脂培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基、PCA培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基：購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉：購自O(shè)XOID公司；菌株測序工作送至北京市理化分析測試中心檢測。

1.2 儀器與設(shè)備

UV mini 1240紫外-分光光度計、LC-10A高效液相色譜儀 日本Shimadzu公司；HPS-250生化培養(yǎng)箱 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；超凈工作臺 北京冠鵬凈化設(shè)備有限責(zé)任公司；F-23 pH 計(精度0.001 g) 日本Horiba公司；YXQ-SG46-280A蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；AR 2140電子天平 美國Ohaus公司；HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；KQ-100E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；TDL-40B臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 丁酸產(chǎn)生菌的分離鑒定方法

1.3.1.1 丁酸梭菌增殖培養(yǎng)基(RCM培養(yǎng)基)的配制方法

胰蛋白胨5 g、0.5% 美藍0.1 mL、三水合乙酸鈉1.5 g、酵母浸膏1.5 g、氯化鈉2.5 g、牛肉浸膏5 g、半胱氨酸鹽0.25 g、瓊脂0.75 g(固體培養(yǎng)基添加)、葡萄糖2.5 g、蒸餾水500 mL，調(diào)節(jié)pH 值為7.0，滅菌20 min后備用。

1.3.1.2 丁酸梭菌選擇性培養(yǎng)基(TSN培養(yǎng)基)的配制方法

瓊脂0.25 g(固體培養(yǎng)基添加)、酵母浸膏5 g、多粘菌素0.025 g、胰蛋白胨7.5 g、亞硫酸鈉0.5 g、新生霉素0.01 g、枸櫞酸鐵0.25 g、蒸餾水500 mL，調(diào)節(jié)pH值為7.0，滅菌20 min后備用。

1.3.1.3 丁酸產(chǎn)生菌的分離培養(yǎng)方法

取新鮮的青方腐乳樣品5.0 g，加45 mL無菌水充分混勻，取混合液0.5 mL接種入裝有4.5 mL丁酸梭菌增殖培養(yǎng)基的滾管中，在37 ℃條件下富集培養(yǎng)，隔24 h進行一次傳代，連續(xù)傳代4～5次。將發(fā)酵液進行梯度稀釋，丁酸梭菌選擇性培養(yǎng)基在滾管中融化，接種，快速混勻，放置冰槽中，連續(xù)滾動至培養(yǎng)基凝固，放置于培養(yǎng)箱中，在37 ℃靜置培養(yǎng)，待菌落形成后，將單個菌落轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，該操作重復(fù)3～4 次，純化每個單菌落。

1.3.1.4 丁酸產(chǎn)生菌篩選

為篩選丁酸產(chǎn)生菌株，采用HPLC 法對單菌株24 h發(fā)酵液中丁酸的含量進行檢測。丁酸的檢測方法參照Zhang等[13]的方法，略有改動。量取菌株發(fā)酵液40 mL，超聲振蕩30 min，8000 r/min離心20 min，取上清液，過0.45 μm濾膜制得樣品提取液。在色譜柱：Shimadzu SCR-101H(10.0mm×7.9 mm×300 mm)；流動相：5 mmol/L的硫酸水溶液；柱溫：40 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：210 nm的色譜條件下進樣檢測，與丁酸標(biāo)準品上樣制得的標(biāo)準曲線比對計算得丁酸含量。

1.3.1.5 丁酸產(chǎn)生菌鑒定

為對丁酸產(chǎn)生菌進行鑒定，測定篩選菌株16S rDNA，并結(jié)合顯微觀察、菌落形態(tài)、生理生化指標(biāo)進行。

1.3.2 乳酸菌發(fā)酵劑的制備

將乳酸菌LB01以2%的接種量接種于MRS 肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)箱中活化24 h，傳代3次后對活化好的菌種進行馴化。馴化過程不斷加大MRS肉湯培養(yǎng)基中豆?jié){的比例，從0% 以10%的梯度逐步增加到100%，每次均在37 ℃培養(yǎng)箱中馴化24 h，將馴化好的菌種以2%接種于100 mL滅菌豆?jié){中，在37 ℃培養(yǎng)12 h后于4 ℃冷藏。

1.3.3 菌懸液制備

將乳酸菌L丁酸梭菌BP01分別接種在MRS固體培養(yǎng)基和梭菌增殖固體培養(yǎng)基上，于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)48 h，加入適量生理鹽水，充分搖動，分別得到菌懸液，鏡檢計數(shù)，調(diào)整其濃度為1×107CFU/mL。

1.3.4 乳酸和丁酸含量測定

使用HPLC法，量取菌株發(fā)酵液40 mL，超聲振蕩30 min，8000 r/min離心20 min，取上清液，過0.45 μm濾膜制得樣品提取液。色譜柱：Shimadzu SCR-101H(10.0 mm×7.9 mm×300 mm)；流動相：5 mmol/L的硫酸水溶液；柱溫：40 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：210 nm的色譜條件下進樣檢測，與乳酸、丁酸標(biāo)準品上樣制得的標(biāo)準曲線比對計算得乳酸、丁酸含量。

1.3.5 微生物菌落計數(shù)

稱取新鮮樣品5 g，加入45 mL滅菌的生理鹽水，渦旋振蕩10 min后，安靜放置20 min，取1 mL放入9 mL生理鹽水中，進行依次10倍的梯度稀釋，在適宜的稀釋度下進行菌落的計數(shù)。細菌在37 ℃條件下，在平板計數(shù)瓊脂上培養(yǎng)48 h后計數(shù)。芽孢菌數(shù)使用營養(yǎng)瓊脂于37 ℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)。乳酸菌使用MRS培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)48 h計數(shù)。丁酸梭菌使用RCM瓊脂培養(yǎng)基于37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后計數(shù)，結(jié)果以log CFU/g 樣品表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

方差分析使用SPSS 23.0 軟件開展，使用鄧肯氏多重域檢驗分析數(shù)據(jù)間的差異性，顯著水平選擇 p<0.05。每個樣品進行2次重復(fù)，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 青方腐乳中丁酸梭菌的分離鑒定

丁酸梭菌是促進腸道微生態(tài)健康的一類重要益生菌，前期研究初步確定了青方腐乳中含有丁酸梭菌，為了利用青方腐乳中的丁酸梭菌，發(fā)揮其在微生態(tài)方面的健康促進作用，本研究采用亨蓋特厭氧方法對青方腐乳中的丁酸梭菌進行分離培養(yǎng)(見圖1)，共選取單菌落12 株，分別測定培養(yǎng)液中的丁酸含量，從而初步篩選丁酸產(chǎn)生菌株。

圖1 亨蓋特厭氧法分離培養(yǎng)丁酸梭菌Fig.1 Isolation and culture of Clostridium butyricum by Hungate anaerobic method

菌株代謝產(chǎn)物中丁酸含量測定采用HPLC法進行，測定結(jié)果見圖2。

圖2 分離菌株代謝產(chǎn)物中丁酸含量的HPLC測定結(jié)果Fig.2 The butyric acid content of metabolites in isolated strains determined by HPLC method

由圖2可知，在篩選出的12株菌中存在2株高產(chǎn)丁酸，分別命名為丁酸產(chǎn)生菌株01(BP01)和丁酸產(chǎn)生菌株02(BP02)，后續(xù)實驗以此2株菌為實驗對象。BP01和BP02菌株培養(yǎng)液中(發(fā)酵48 h)的丁酸含量分別達到6.48，3.27 mmol/L。選擇BP01菌株進一步進行分子生物學(xué)的鑒定，提取該菌株的基因組DNA，以其DNA為模板進行16S rDNA擴增，對目的條帶回收后進行克隆測序，結(jié)果表明，BP01菌株的16S rDNA基因序列長度為1449 bp，將該序列在GeneBank中進行相似性的比對。

將BP01菌株的16S rDNA序列提交NCBI，使用Blast 程序進行比對分析，共發(fā)現(xiàn)16 個同源性最高的菌種(見表1)，對其分析發(fā)現(xiàn)這16個菌株均為丁酸梭菌，因此，可以從分子生物學(xué)角度判定BP01菌株為丁酸梭菌。

對BP02 菌株16S rDNA 的RCR 擴增產(chǎn)物進行測序，其16S rDNA基因序列長度為1377 bp，進一步在NCBI上進行相似性比對，初步確定其為雙酶梭菌(Clostridiumbifermentans)，在NCBI 上的登錄號為：JX267051.1，鑒于BP01菌株丁酸產(chǎn)生量較大，并且其作為益生菌認可度較高，因此，后續(xù)實驗以BP01菌株作為研究對象。

表1 NCBI上與BP01菌株同源性較高的菌株Table 1 The strains with high homology with BP01 in NCBI

續(xù) 表

2.2 丁酸梭菌與乳酸菌共培養(yǎng)對乳酸菌的影響

共培養(yǎng)又稱混菌培養(yǎng)或混合培養(yǎng)，也稱混合發(fā)酵，由于不同微生物群體之間可能存在互利共生的關(guān)系，因此，當(dāng)將幾種微生物共培養(yǎng)時，可能產(chǎn)生優(yōu)于單菌培養(yǎng)的效果。有學(xué)者的研究顯示，菌株混合培養(yǎng)在提高菌株生理代謝功效及生物量方面效果明顯，可產(chǎn)生比純培養(yǎng)更好的效果[14,15]。乳酸菌和丁酸梭菌作為人和動物腸道的益生菌有互利共生的潛在可能性，因此，本研究對從腐乳中分離的乳酸菌LB01和丁酸梭菌BP01進行共培養(yǎng)研究。結(jié)果表明，乳酸菌LB01單獨培養(yǎng)時，發(fā)酵液pH 值迅速降低(見圖3)，將丁酸梭菌BP01與其共培養(yǎng)，發(fā)酵液pH值降低速度減緩，在培養(yǎng)24 h 時，兩種發(fā)酵液pH值差異顯著(p<0.05)，進一步對乳酸菌LB01單獨培養(yǎng)和與丁酸梭菌BP01共培養(yǎng)過程中乳酸濃度進行測定，結(jié)果見圖4。乳酸菌LB01單獨培養(yǎng)時，發(fā)酵液乳酸含量迅速增加，在發(fā)酵24 h時達到34.6 mmol/L，而與丁酸梭菌BP01共培養(yǎng)時，乳酸濃度增加相對緩慢，且與乳酸菌LB01單獨培養(yǎng)時差異顯著。這可能是由于共培養(yǎng)時，丁酸梭菌BP01消耗了部分乳酸，延緩了發(fā)酵液中乳酸含量的增加和pH值的降低。這與前期實驗中發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌BP01可以利用乳酸支持生長相一致，也和乳酸菌與丁酸梭菌的益生特性相符。人和動物腸道中存在大量乳酸菌，代謝產(chǎn)生乳酸，而健康人的糞便中幾乎檢測不到乳酸，這和腸道中存在的丁酸梭菌等益生菌利用乳酸調(diào)節(jié)腸道pH 值，防止因乳酸積累引起酸中毒相關(guān)。

圖3 發(fā)酵液pH值變化曲線Fig.3 Changes in pH values of fermentation broth

圖4 發(fā)酵液乳酸濃度變化曲線Fig.4 Changes in lactic acid concentration of fermentation broth

使用MRS 培養(yǎng)基對發(fā)酵24 h 的發(fā)酵液中乳酸菌進行計數(shù)，結(jié)果見圖5。乳酸菌LB01單獨培養(yǎng)24 h 時，發(fā)酵液中菌株數(shù)量達7.5×107CFU/mL，與丁酸梭菌BP01共培養(yǎng)時，乳酸菌LB01的生長沒有受到抑制，相反，丁酸梭菌BP01 有促進乳酸菌LB01生長的現(xiàn)象，共培養(yǎng)24 h后，乳酸菌LB01數(shù)量達9.8×107CFU/mL，這表明丁酸梭菌BP01能很好地促進乳酸菌LB01生長，可使其發(fā)酵24 h的活菌數(shù)提高30.7%。

發(fā)酵24 h后，丁酸梭菌BP01與乳酸菌LB01共培養(yǎng)的活菌數(shù)要明顯高于丁酸梭菌BP01單獨培養(yǎng)的活菌數(shù)，分別為10.8×106CFU/mL和6.5×106CFU/mL，表明乳酸菌LB01對丁酸梭菌BP01具有很好的促生長作用。進一步對培養(yǎng)24 h的發(fā)酵液中丁酸含量進行測定，見圖7。

圖5 培養(yǎng)24 h的發(fā)酵液中乳酸菌數(shù)量Fig.5 The number of lactic acid bacteria in fermentation broth cultured for 24 h

2.3 丁酸梭菌與乳酸菌共培養(yǎng)對丁酸梭菌的影響

對培養(yǎng)24 h的發(fā)酵液中丁酸梭菌數(shù)量進行測定，結(jié)果見圖6。

圖6 培養(yǎng)24 h的發(fā)酵液中丁酸梭菌數(shù)量Fig.6 The number of Clostridium butyricum in fermentation broth cultured for 24 h

圖7 培養(yǎng)24 h的發(fā)酵液中丁酸含量Fig.7 The butyric acid content in fermentation broth cultured for 24 h

由圖7可知，丁酸梭菌BP01單獨培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液中丁酸含量可達6.5 mmol/L，與乳酸菌LB01共培養(yǎng)時，發(fā)酵液中丁酸含量明顯上升，培養(yǎng)24 h 時達到10.2 mmol/L，而乳酸菌LB01單獨培養(yǎng)時，發(fā)酵液中未檢測到丁酸，進一步驗證了乳酸菌LB01和丁酸梭菌BP01有很好的互利共生關(guān)系，可以在后續(xù)實驗中進行共同培養(yǎng)發(fā)酵。目前已有學(xué)者使用復(fù)合益生菌開發(fā)新產(chǎn)品，提升產(chǎn)品品質(zhì)，例如，胡強等[16]將分別來自于動物和植物的益生菌共培養(yǎng)開發(fā)了新型復(fù)合益生菌調(diào)味筍，提升了產(chǎn)品的益生功效。

3 結(jié)論

本研究在前期實驗基礎(chǔ)上從青方腐乳中分離出丁酸產(chǎn)生菌，分子生物學(xué)鑒定為丁酸梭菌，丁酸梭菌BP01與乳酸菌LB01共培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)，二者具有互利共生關(guān)系，丁酸梭菌BP01 可以促進乳酸菌LB01生長，使其發(fā)酵24 h的活菌數(shù)提高30.7%，可防止乳酸過度積累，乳酸菌LB01也可促進丁酸梭菌BP01生長，共培養(yǎng)24 h發(fā)酵液中丁酸含量明顯上升，由單獨培養(yǎng)6.5 mmol/L增加為10.2 mmol/L，研究結(jié)果可為益生菌在青方腐乳中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。