孫盛梅,溫達靜,趙東旭,周海瑞,于春楊,郭 靖,董子鈺

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

健康女性陰道存在多種微生物，與人體內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和免疫機制、陰道內(nèi)酸堿度處于動態(tài)平衡狀態(tài)。在正常女性陰道微生態(tài)中乳酸桿菌占據(jù)優(yōu)勢地位，大量研究表明，乳酸桿菌分解多種糖類產(chǎn)生大量細菌素及表面活性劑來抑制致病菌，通過產(chǎn)生乳酸及過氧化氫等物質(zhì)調(diào)整陰道內(nèi)環(huán)境。當陰道內(nèi)感染致病菌，并迅速增殖，出現(xiàn)菌群失調(diào)，此時乳酸桿菌減少或不變，喪失優(yōu)勢地位，單一抑制細菌而不糾正陰道菌群失衡狀態(tài)，治療后陰道仍然處于易感狀態(tài)，這是陰道炎癥復發(fā)的主要原因。

蛇床子為傘形科植物，取成熟的果實，干燥后入藥，對心血管系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等都有優(yōu)異的保護作用。胡玉紅、張燕等[1]研究表明：蛇床子中酚類物質(zhì)、單菇醇等物質(zhì)對陰道菌群有抑菌作用，其有效成分主要來自蛇床子揮發(fā)油。毛櫻逾等[2]研究表明蛇床子不影響乳酸桿菌的產(chǎn)酸能力，甚至提高乳酸桿菌的產(chǎn)酸能力。蛇床子有止癢作用，能有效緩解頑固性外陰瘙癢,有顯著的治療效果[3]。由于陰道微生態(tài)中多種微生物共存，乳酸桿菌與金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、大腸桿菌等微生物相互抑制、相互依存，因此，在菌群失調(diào)模型的治療中，療效單一的藥物很難達到治療目的。因此，本實驗主要探究蛇床子提取物在拮抗陰道中致病菌：金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和大腸桿菌的作用，以及對乳酸桿菌的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗菌種和材料

菌種：大腸桿菌、白色念珠菌和金黃色葡萄球菌，以及乳酸桿菌菌種均由佳木斯大學附屬第一醫(yī)院檢驗科微生物中心提供。蛇床子：購自佳木斯中醫(yī)院藥店。培養(yǎng)基：MRS選擇性培養(yǎng)基，血瓊脂平板、大腸桿菌顯色培養(yǎng)基、沙氏培養(yǎng)基等購自環(huán)凱微生物公司。

1.2 實驗對象

昆明小鼠160只，雌性、體重范圍在(15±2)g，購自哈爾濱醫(yī)科大學動物中心。

1.3 實驗方法

1.3.1 藥物提取和菌種活化

蛇床子提取物的制備：蛇床子50g，粉碎,過20目篩,用75%體積分數(shù)的乙醇溶液浸泡后進行超聲提取，每次1h，間隔分為3次進行，置于4℃，調(diào)整到8000rpm，離心10min，紗布過濾,所得濾液回收乙醇,并濃縮至50mL,即得1g/mL質(zhì)量濃度的藥液，分裝備用[4]

將四種實驗菌種分別轉(zhuǎn)種活化、接種到各自增菌培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)24～48h，其中乳酸桿菌置于厭氧罐中培養(yǎng)，用滅菌環(huán)形接種環(huán)挑取培養(yǎng)基表面的單個菌落，導入盛有生理鹽水的試管中攪拌、充分震蕩，分別制成0.5麥氏濁度混懸液[5]。

1.3.2 體外探究蛇床子提取物的MIC值

取96孔細菌培養(yǎng)板，標記分組。A、B、C、D四排分別標記為乳酸桿菌組、大腸桿菌組、白色念珠菌組和金黃色葡萄球菌組。從左至右依次編號為：1～10號。A、B、C、D組1號孔加入小牛血清150μL，2～10號孔均加入小牛血清100μL，A、B、C、D組1號孔加入蛇床子提取物藥液50μL，采用倍比稀釋法將1號孔的藥物2倍稀釋直至第8孔，每組1～9孔定量加入對應0.5麥氏濁度的菌懸液100μL，最終1～9號孔對應的藥物濃度分別為：125.00g/L，62.50g/L，31.25g/L，15.63g/L，7.81g/L，3.91g/L，1.95g/L；0.98g/L ，9號孔為陽性對照孔，10號孔為空白對照孔。恒溫 37℃，培養(yǎng) 24～48h，置于實驗臺，觀察以無菌生長孔所對應的蛇床子提取物質(zhì)量濃度為最低抑菌濃度 (MIC值)，見表1。選取三種致病菌中最高的MIC值：7.81g/L，為第二階段動物實驗中藥物的有效藥物濃度。

1.3.3 蛇床子提取物對小鼠陰道菌群的影響

創(chuàng)建小鼠陰道菌群失調(diào)模型：隨機將160只小鼠分為四組：1號乳酸桿菌組、2號大腸桿菌組、3號白色念珠菌組和4號金黃色葡萄球菌組，每組40只。實驗1～4號組，每組全部小鼠陰道內(nèi)均注入20μL該組對應的菌懸液，連續(xù)5d。第7天采集1～4組陰道沖洗液，稀釋后分別接種到對應培養(yǎng)基，1號組置于厭氧袋中，37℃培養(yǎng)48h后菌落計數(shù)，連續(xù)檢測2d。從實驗第9天起，將已建成的陰道菌群失調(diào)模型1～4號組內(nèi)再隨機分成兩組：對照組及治療組，每組20只。對照組每日用60μL生理鹽水沖洗陰道；治療組用60μL，質(zhì)量濃度為7.81g/L的蛇床子提取物藥液沖洗陰道，連續(xù)10d。療程結束后48h依照以上方法檢測各組小鼠陰道內(nèi)實驗菌的菌落數(shù)，連續(xù)檢測2d。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

本實驗測得蛇床子提取物對大腸桿菌、白色念珠菌和金黃色葡萄球菌的MIC值分別為3.91g/L、7.81g/L和3.91g/L。取三者最高MIC值，即質(zhì)量濃度為7.81g/L的蛇床子提取物藥液，進行小鼠菌群失調(diào)模型的治療。應用蛇床子治療前，1～4號組各組內(nèi)對照組及實驗組陰道菌落數(shù)對比(P>0.05)差別無統(tǒng)計學意義，證明各組菌群失調(diào)模型間感染嚴重程度無差異。1號組中實驗組乳酸桿菌治療前、后差距無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，對照組治療前、后無明顯變化，差距無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2；2號組中實驗組大腸桿菌治療后較治療前明顯下降，差距有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，對照組治療后較治療前無明顯變化，差距無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3；3號組中白色念珠菌實驗組治療后較治療前明顯下降，差距有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，對照組治療前、后無明顯變化，差距無統(tǒng)計學意義(P>0.05), 見表4；4號組中實驗組金黃色葡萄球菌治療后較治療前相比明顯降低，差距有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，對照組治療前、后相比無明顯變化，差距無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表5。

表1 蛇床子提取物對4種實驗菌種的影響(n=20)

表2 乳酸桿菌組中對照組和實驗組給藥前、 后菌落數(shù)變化

表3 大腸桿菌組中對照組和實驗組給藥前、 后菌落數(shù)變化

表4 白色念珠菌組中對照組和實驗組給藥前、 后菌落數(shù)變化

表5 金黃色葡萄球菌組中對照組和實驗組給藥 前、后菌落數(shù)變化

3 討論

本實驗方法簡便、經(jīng)濟可行，明確了蛇床子提取物對小鼠陰道3種常見致病菌的抑菌活性并測得各致病菌的MIC值。為動物實驗提供理論支持，選取3種致病菌的最高MIC值作為治療菌群失調(diào)模型的最適藥物濃度，起到預實驗效果，避免直接動物陰道內(nèi)注入不同濃度梯度的藥液，出現(xiàn)藥物濃度過高對小鼠陰道壁細胞的損傷，影響實驗結論。乳酸桿菌在本實驗最高藥物濃度，即125g/L的藥液中仍能繼續(xù)生長，且相關文獻表明蛇床子不影響乳酸桿菌的產(chǎn)酸能力甚至有增強作用。因此蛇床子提取物對乳酸桿菌的促進作用顯而易見，綜合馮鋒, 楊建宏等[6]研究表明蛇床子提取物有止癢作用，能顯著提高磷酸組織胺致癢閾，且對解脲支原體的最低抑菌濃度為 62.5～125μg/mL，與本實驗所得MIC值相符。楊小進，張華菲等[7]研究表明： 乳酸桿菌對本實驗3種受試菌有顯著抑菌作用。提高乳酸桿菌的優(yōu)勢地位，分解糖原產(chǎn)生乳酸及抑菌物質(zhì)，或通過生物奪氧方式、黏附機制和競爭排斥作用抑制致病菌的繁殖，具有良好的抑菌作用[8]。綜合以上說明蛇床子對于陰道炎癥的治療具有增加乳酸桿菌數(shù)目、提高乳酸桿菌產(chǎn)酸及抑菌能力、抑制解脲支原體、止癢等多重功效。對提高陰道炎臨床遠期療效，實現(xiàn)單一藥物，多效、低毒、抑菌合并重建陰道微生態(tài)有臨床意義。