李永川

卵巢癌是一種女性生殖器官常見惡性腫瘤，好發(fā)于絕經(jīng)期女性，病死率居婦科惡性腫瘤首位。其發(fā)病隱匿，缺乏早期篩查方法，卵巢癌進(jìn)展迅速，多數(shù)確診患者已屬晚期且伴隨廣泛轉(zhuǎn)移，手術(shù)不能完全切除[1]。因此目前臨床常用腫瘤減滅術(shù)加以鉑類藥物為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療，但其治療效果不理想，大部分患者一線化療后出現(xiàn)繼發(fā)性鉑類耐藥，導(dǎo)致復(fù)發(fā)性卵巢癌患者預(yù)后極差，至今卵巢癌患者5年生存率不超過30%[2,3]。因此，明確卵巢癌耐藥分子機(jī)制，對尋找有效耐藥逆轉(zhuǎn)劑和新的治療靶標(biāo)，提高卵巢癌化療預(yù)后意義重大。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度>200個核苷酸的非編碼RNA，基因間長片段非編碼RNA(lincRNAs)屬于lncRNA的一類，在多物種中保守型很高，可引導(dǎo)染色質(zhì)修飾符合物到特定基因位點，調(diào)控基因表達(dá)[4]。鉑類藥物主要與DNA交聯(lián)，誘發(fā)DNA損傷，lincRNAs可能參與卵巢癌鉑類耐藥的作用機(jī)制[5]，但關(guān)于lincRNAs與鉑類耐藥相關(guān)性研究筆者發(fā)現(xiàn)尚鮮有報道。因此本研究擬觀察LINC00515在漿液性卵巢癌中的表達(dá)，以期探究其與鉑類耐藥及患者預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2012年2月至2014年1月我院收治的漿液性卵巢癌患者92例，年齡35～72歲，平均年齡(55.25±15.65)歲；其中≥55歲者51例，<55歲者41例。參照2009年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obsterics,FIGO)卵巢癌惡性腫瘤手術(shù)病理分期標(biāo)準(zhǔn)[1]，Ⅰ+Ⅱ期36例，Ⅲ+Ⅳ期56例。參照WTO標(biāo)準(zhǔn)，腫瘤病理學(xué)分級G1+G2級64例，G3級28例。根據(jù)腫瘤直徑大小分為≥4 cm者18例，<4 cm者74例。按照有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分有淋巴轉(zhuǎn)移20例，無淋巴轉(zhuǎn)移72例。按照有無遠(yuǎn)處(肝、肺等)轉(zhuǎn)移分為有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移28例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移64例。根據(jù)美國婦科腫瘤學(xué)建議分型[6]，分為鉑類敏感組(敏感組)50例，鉑類耐藥組(耐藥組)42例，2組患者年齡、腫瘤直徑、病理分級及FIGO分期差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)?；颊咴诼殉舱g(shù)中收集卵巢癌組織及距離癌癥組織>1 cm處正常癌旁組織，所有組織離體后迅速置于液氮中低溫保存?zhèn)溆?。樣品采集均取得患者及其家屬知情同意并簽字確認(rèn)，本研究經(jīng)過醫(yī)院道德倫理委員會批準(zhǔn)通過。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 參照《婦產(chǎn)科學(xué)》關(guān)于漿液性卵巢癌的診斷[7]。

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理證實確診為漿液性卵巢癌的患者；②無既往腫瘤、血栓病史者；③術(shù)前未接受全身或局部化療、放療及激素藥物治療者；④自愿接受調(diào)查研究，并能完成臨床記錄者；⑤均為首次進(jìn)行手術(shù)，術(shù)后進(jìn)行以鉑類藥物為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有嚴(yán)重急、慢性感染性疾病者；②有手術(shù)禁忌、不耐手術(shù)者；③心、肝、腎等重要臟器功能障礙或其他惡性腫瘤者；④不自愿接受治療調(diào)查研究者；⑤隨訪資料不完整者。

1.3 研究方法

1.3.1 主要試劑與儀器：Trizol試劑(貨號：R0016，上海碧云天)； PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)(貨號：RR037A，TaKaRa)、PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(貨號：6210A，TaKaRa)；引物由上海生工合成；紫外分光光度計(美國 Thermo 公司)、RT-qPCR儀7500(美國Bio-Rad公司)等。

1.3.2 實時定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)法檢測患者卵巢組織中LINC00515的表達(dá)水平：采用Trizol法提取卵巢組織樣品總RNA，用紫外分光光度計檢測總RNA濃度及純度。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，后將其置于-20℃保存?zhèn)溆?。采用RT-qPCR法檢測LINC00515表達(dá)水平。RT-qPCR采用20 L反應(yīng)體系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×) 10 μl，ROX Reference Dye or Dye Ⅱ(50×)0.4 L，cDNA(50 ng/L)2 L，上下游引物(10 mmol/L)各0.8 L，ddH2O 6.0 μl。反應(yīng)采用兩步法，條件設(shè)置為：95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，34 s，共反應(yīng)40個循環(huán)；添加溶解曲線。采用2-ΔΔCT法對卵巢組織中LINC00515的相對表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.4 鉑類藥物療效評定標(biāo)準(zhǔn) 患者初次手術(shù)后10 d開始化療，紫杉醇175 mg/m2、順鉑75 mg/m2，靜脈滴注。21 d為1個療程，根據(jù)患者病情共進(jìn)行6～8個療程。根據(jù)美國婦科腫瘤學(xué)建議分型[6]，鉑類敏感：初次采用鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療緩解后，停止治療后超過6個月出現(xiàn)復(fù)發(fā)者；鉑類耐藥：初次采用鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療緩解后，停止治療后6個月內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)者；難治性卵巢癌：對化療無效，或化療至少6個療程最好反應(yīng)為部分緩解或初步穩(wěn)定。本研究難治性卵巢癌歸入鉑類耐藥組進(jìn)行研究。

1.5 隨訪 對漿液性卵巢癌患者化療緩解后進(jìn)行電話或門診隨訪，隨訪時間為1～60個月，截止日期為2019年1月31日或患者復(fù)發(fā)或死亡時間。

2 結(jié)果

2.1 癌旁與卵巢癌組織中LINC00515的表達(dá)比較 與癌旁組織比較，漿液性卵巢癌患者卵巢癌組織中LINC00515表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.2 敏感組和耐藥組漿液性卵巢癌組織中LINC00515的表達(dá)比較 與敏感組比較，耐藥組漿液性卵巢癌患者卵巢癌組織中LINC00515表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表2 癌旁與卵巢癌組織中LINC00515的表達(dá)比較

表3 敏感組和耐藥組漿液性卵巢癌組織中LINC00515的表達(dá)比較

2.3 LINC00515表達(dá)與漿液性卵巢癌患者臨床病理特征的關(guān)系 以LINC00515表達(dá)水平平均數(shù)(0.56)為界，將漿液性卵巢癌患者分為LINC00515高表達(dá)組(n=53)和低表達(dá)組(n=39)。LINC00515在漿液性卵巢癌患者癌癥組織中的表達(dá)水平與患者的年齡、腫瘤直徑無關(guān)(P>0.05)，與FIGO分期、病理分級、淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及鉑類耐藥情況有關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 LINC00515在漿液性卵巢癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

2.4 COX分析影響漿液性卵巢癌患者不良預(yù)后的危險因素 單因素分析顯示，LINC00515、FIGO分期、淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及鉑類耐藥是患者不良預(yù)后的危險因素(P<0.05)。多因素分析顯示，LINC00515、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及鉑類耐藥是影響患者不良預(yù)后的獨立危險因素(HR=2.569，95% CI為1.727～3.812；HR=1.526，95% CI為1.293～1.801，HR=2.473，95% CI為1.461～4.186；P<0.05)。見表5。

2.5 LINC00515在漿液性卵巢癌患者卵巢組織中的表達(dá)與患者總生存率的關(guān)系 至隨訪結(jié)束時，漿液性卵巢癌患者死亡65例，存活27例，5年總生存率為29.35%。Kaplan-Meier生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，LINC00515高表達(dá)組漿液性卵巢癌患者5年存活率為41.51%，LINC00515低表達(dá)組漿液性卵巢癌患者預(yù)后5年存活率為15.39%，低表達(dá)組存活率顯著低于高表達(dá)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.533，P=0.0035)。見圖1。

圖1 LINC00515表達(dá)水平與漿液性卵巢癌患者5年生存率的關(guān)系

3 討論

卵巢癌的治療方案一般根據(jù)其組織學(xué)分類進(jìn)行選擇，約90%卵巢癌為上皮性卵巢癌，其主要組織類型包括高級別漿液性、低級別漿液性、子宮內(nèi)膜樣、透明細(xì)胞和粘液性等[8]。其中高級別漿液性卵巢癌占上皮性卵巢癌2/3以上，高級別漿液性卵巢癌死亡人數(shù)占上皮性卵巢癌患者死亡總?cè)藬?shù)70%～80%[9]。由于卵巢癌位于盆腔深部，發(fā)病隱匿，臨床缺乏特異性檢測指標(biāo)，早期篩查不易，75%的患者一經(jīng)發(fā)現(xiàn)已進(jìn)入中晚期[10]。目前上皮性卵巢癌常用治療方案為全面分期手術(shù)或腫瘤減滅術(shù)，術(shù)后一般采取鉑類藥物為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療，但卵巢癌患者5年生存率并未顯著提高，而鉑類耐藥是其治療失敗的主要原因[11]。對卵巢癌鉑類耐藥的發(fā)生機(jī)制并不明確。因此尋找與鉑類耐藥相關(guān)的分子，探究鉑類耐藥機(jī)制成為目前研究熱點。

LincRNA屬于lncRNA的一種，在生物體中有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能[4]，廣泛參與腫瘤細(xì)胞對DNA損傷的應(yīng)答[12]，但目前相關(guān)研究均處于起步階段。Lu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，LINC00515在抗黑素瘤骨髓瘤細(xì)胞中高表達(dá)。Tian等[14]研究發(fā)現(xiàn)，LINC00515在I期肺腺癌組織中低表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，LINC00515在漿液性卵巢癌組織中低表達(dá)，且在漿液性卵巢癌鉑類耐藥組癌組織中低表達(dá)，提示LINC00515可能在不同癌癥組織中表達(dá)模式不同，其低表達(dá)可能與漿液性卵巢癌鉑類耐藥有關(guān)，但還需進(jìn)一步深入研究。

杜曉琴[15]研究發(fā)現(xiàn)，Lnc RNA KCNQ1OT1表達(dá)與FIGO分期、腫瘤分級和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。郭春芳等[16]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA NEAT1和CTBP2表達(dá)水平與卵巢癌FIGO分期、腫瘤分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LINC00515在漿液性卵巢癌患者癌癥組織中的表達(dá)與患者FIGO分期、病理分級、淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及鉑類耐藥有關(guān)，提示LINC00515可能與漿液性卵巢癌患者嚴(yán)重程度有關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)LINC00515低表達(dá)組漿液性卵巢癌患者5年存活率顯著低于高表達(dá)組，提示LINC00515低表達(dá)可能與漿液性卵巢癌患者生存率低有關(guān)。COX分析進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，LINC00515表達(dá)水平、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及鉑類耐藥是影響漿液性卵巢癌患者不良預(yù)后的獨立危險因素，提示LINC00515低表達(dá)可能與漿液性卵巢癌患者預(yù)后差及鉑類耐藥有關(guān)。

綜上所述，LINC00515在漿液性卵巢癌卵巢組織中低表達(dá)，其表達(dá)水平與患者鉑類耐藥及預(yù)后有關(guān)。