利榮喬，陳 暉，藍欲裕，姚人業(yè)

1.廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院檢驗科，廣西南寧 530000；2.廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院檢驗科，廣西南寧 530000

妊娠期肝內膽汁淤積癥(ICP)是妊娠期一種重要的并發(fā)癥，其可致孕婦皮膚瘙癢、黃疸、早產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)，致胎兒宮內窘迫、中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺氧損傷，該疾病導致圍生兒發(fā)病率和病死率增加。研究表明，疏水性膽汁酸在ICP發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1-2]。此外，雌激素受體α(ERα)在轉錄和翻譯水平均受miR-18a的負性調控[3]，提示miR-18a可能通過調控ERα的表達，進而調控膽汁酸，特別是疏水性膽汁酸的體內淤積，在ICP的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究旨在探討ICP患者血清miR-18a水平與血清硫水性膽汁酸的相關性。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 根據(jù)隨機數(shù)字表法隨機選取2017年12月至2019年3月廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院確診的120例輕度、中度、重度ICP患者各40例及同期健康孕婦40例，孕婦年齡為22～34歲，平均(28±4)歲；孕周為28～37周，平均(32.0±4.3)周。4組孕婦一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。納入標準：臨床資料完整；單胎妊娠；妊娠前檢查未見瘙癢，妊娠期出現(xiàn)瘙癢，且瘙癢只與妊娠有關。排除標準：肝炎患者、嚴重妊娠期合并癥或并發(fā)癥者及其他不適合參加本次研究者。

1.2ICP患者分度診斷標準 輕度ICP：總膽汁酸(TBA)≥10～<40 μmol/L，總膽紅素(TBIL)<20 μmol/L；中度ICP：TBA≥40～<80 μmol/L，TBIL≥20～<40 μmol/L；重度ICP：TBA≥80 μmol/L，TBIL≥40 μmol/L[4-5]。

1.3儀器與試劑 RNAiso Blood(貨號：9112)，逆轉錄試劑盒(貨號：RR037)及TB Green Premix Taq(貨號：RR820)擴增試劑均購自Takara公司，has-miR18a及U6逆轉錄和擴增引物由上海生工合成。熒光定量PCR儀為Agilent AriaMx。 has-miR18a引物：上游：5′-GGG GTG TTC TAA GGT GCA TCT A-3′；下游：5′-CAG TGC GTG TCG TGG AGT-3′；U6引物：上游：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′；下游：5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。

1.4方法 孕婦入院接受腹部超聲檢查，明確孕期；清晨安靜空腹狀態(tài)下抽取外周血標本5 mL，妥善保存后送檢實驗室進行處理及檢測。標品標準化前處理后采用高效液相色譜串聯(lián)質譜法檢測脫氧膽酸(DCA)、鵝脫氧膽酸(CDCA)，甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)和石膽酸(LCA)水平，色譜條件：pH 1～12柱100 μm×23 μm，預柱為Luna C18(2) 3 μm (10 mm×2 mm)柱，流速：0.20 mL/min，柱溫：35 ℃，流動相:甲酸氨水溶液體積比為1∶200，乙酸水溶液(用氨水調節(jié)pH=4.5)∶甲醇為30∶70；質譜條件：ESI選擇性正離子檢測，SIM方式檢測。工作參數(shù)：干燥氮氣溫度200 ℃，霧化器流量1.5 L/min，檢測電壓1.40 kV。

2 結 果

2.1各組孕婦血清中miR-18a水平比較 與健康對照組比較，輕度、中度和重度ICP組血清中miR-18a水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與輕度ICP組比較，中度和重度ICP組血清中miR-18a水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與中度ICP組比較，重度ICP組血清中miR-18a水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組孕婦血清中miR-18a水平

2.2各組孕婦血清中DCA、CDCA、GCDCA、LCA水平比較 與健康對照組比較，輕度、中度和重度ICP組血清中DCA、CDCA、GCDCA、LCA水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與輕度ICP組比較，中度和重度ICP組血清中DCA、CDCA、GCDCA、LCA水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與中度ICP組比較，重度ICP組血清中DCA、CDCA、GCDCA、LCA水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組孕婦血清中DCA、CDCA、GCDCA、LCA水平

2.3各組孕婦血清miR-18a與DCA、CDCA、GCDCA、LCA水平的相關性分析 健康對照組孕婦血清miR-18a水平與DCA、CDCA、GCDCA、LCA水平均不相關(P>0.05)；輕度、中度及重度ICP組孕婦血清miR-18a水平與DCA、CDCA、GCDCA、LCA水平均呈負相關(r=-0.847～-0.531,P<0.05)。見表3。

表3 各組孕婦血清miR-18a與DCA、CDCA、GCDCA、LCA水平的相關性分析

3 討 論

ICP多發(fā)生于妊娠中晚期，屬可逆性膽汁淤積癥，ICP 的病因是多因素的，遺傳易感性、激素和環(huán)境因素在其發(fā)病機制中相互作用。其臨床特點是妊娠30周后開始出現(xiàn)輕微或者嚴重瘙癢癥狀，通常在分娩后 48 h 癥狀緩解。除了難治性瘙癢和產(chǎn)后出血，孕產(chǎn)婦的預后通常是良好的。但ICP與胎兒發(fā)病率和病死率密切有關，特別是早產(chǎn)、胎兒窘迫和突然的不可預測的胎兒宮內死亡。

ICP 與TBA水平升高有關。本研究表明，疏水性膽汁酸與ICP的發(fā)生、發(fā)展密切相關。膽汁酸分子內既含有親水性的羥基及羧基，又含有疏水性烴核和甲基。親水基團均為α型，而甲基為β型，兩類不同性質的基團位于環(huán)戊烷多氫菲核的兩側，這種構型使得膽汁酸有疏水性和親水性兩種性質。疏水性膽汁酸包括膽酸(CA)、DCA、CDCA、GCDCA和LCA，其疏水性的大小順序依次為LCA>GCDCA>DCA>CDCA>CA。疏水性膽汁酸能破壞細胞基底外膜、細胞器膜并特異性破壞微管膜的外層，對機體危害較大[6-7]。疏水性膽汁酸損傷細胞的機制與以下機制有關：(1)作為炎癥刺激劑活化細胞內信號轉導途徑，直接刺激促炎介質的產(chǎn)生；(2)引起線粒體機能障礙，導致過量活性氧的產(chǎn)生和內膜通透性的改變；(3)通過內質網(wǎng)應激介導細胞損傷[8-10]。

ICP多發(fā)生于妊娠晚期、多胎妊娠、既往有口服高雌激素水平避孕藥的女性，此類人群雌激素均處于高水平狀態(tài)，提示ICP發(fā)生與雌激素有關[11]。ICP在多胎孕婦中的患病率是單胎孕婦的5倍，這與更高水平的雌激素是相關的。ICP與其他類型膽汁淤積相似，在使用過含雌激素劑量大的避孕藥的女性中發(fā)生率較高。有研究證明，雌激素能夠抑制血糖利用，促進脂肪分解，釋放游離脂肪酸，而高水平游離脂肪酸誘發(fā)肝臟損傷，進而加重膽汁淤積。當機體內部雌激素代謝產(chǎn)物增加時可導致膽汁排泄受阻，從而影響肝臟對硫酸鹽的代謝及排泄，表明高水平的雌激素可能通過受損硫酸鹽化作用和膽汁酸運輸誘導肝內膽汁淤積。ERα在人體內廣泛分布，與其他亞型受體互補共存，共同介導雌激素在靶器官中發(fā)揮效應。而在胚胎著床、胎盤發(fā)育等妊娠生理過程中，ERα更是起到重要生理介導作用。研究表明，ERα的異常表達可能與病理妊娠相關[12-13]。miRNA是一類非編碼小分子RNA，通過與靶mRNA的3′非編碼區(qū)結合后調控相關基因轉錄翻譯，進而影響細胞生理過程，既往研究表明，ERα在轉錄和翻譯水平均受miR-18a的負性調控[3]。

本研究發(fā)現(xiàn)，各ICP組血清疏水性LCA、GCDCA、DCA和CDCA水平明顯高于健康對照組，且隨病情加重，LCA、GCDCA、DCA和CDCA水平越高；各ICP組血清miR-18a明顯下調，且隨病情加重，miR-18a水平越低。ICP組血清miR-18a水平與疏水性膽汁酸水平呈負相關(r=-0.847～-0.531;P<0.05)。因miR-18a可負性調控ERα，筆者推測，血清miR-18a水平下調的孕婦，其組織ERα水平上調，致其對雌激素的敏感性升高，進而導致疏水性膽汁酸在體內積聚，對胎兒造成危害，同時亦損傷孕婦肝細胞，形成惡性循環(huán)。ICP的診斷需要排除其他膽汁淤積和肝臟疾病，miR-18a有望成為ICP診斷的新血清學標志物，也有望成為鑒別診斷ICP 的新依據(jù)，值得進一步深入研究。