唐 婧,李欲軻,何馨竹,湯曉辛

(貴州師范大學(xué) 貴州省植物生理與發(fā)育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/生命科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽 550001)

0 引言

中國是一個(gè)巖溶大國，喀斯特區(qū)域達(dá)346.3萬km2[1]。貴州因地處西南喀斯特的核心區(qū)域，故喀斯特地貌最為典型。由于喀斯特地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)脆弱、土壤層淺薄，易出現(xiàn)生態(tài)系統(tǒng)退化[2]及“石漠化現(xiàn)象”(石漠化作為我國土地荒漠化的主要類型之一，并以每年2 500 km2的速度不斷擴(kuò)展[3])，不僅制約了西南地區(qū)經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展，也增加了當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)系統(tǒng)恢復(fù)的難度。

土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，不僅在生物化學(xué)循環(huán)、有機(jī)物質(zhì)分解等方面起著至關(guān)重要的作用，與土壤性質(zhì)、地上植被之間也具有十分密切的關(guān)系[4-6]。如：喀斯特生態(tài)系統(tǒng)的改變會(huì)造成土壤肥力降低[7]及土壤微生物生物量降低[8-9]；土壤微生物生物量可作為指示生態(tài)系統(tǒng)退化的指示器[10]；土壤微生物多樣性指標(biāo)可視為最具潛力的敏感性生物指標(biāo)之一[11]?？梢?，土壤微生物群落與生態(tài)環(huán)境之間具有十分密切的關(guān)系。以貴州施秉為典型代表的白云巖喀斯特[12]是世界熱帶-亞熱帶喀斯特發(fā)育類型的杰出代表，其地貌演化環(huán)境獨(dú)特、地質(zhì)演化過程復(fù)雜、地貌組合形態(tài)豐富及生態(tài)保護(hù)完好，具有極高的研究價(jià)值。然而，對(duì)白云巖喀斯特土壤微生物的種類和多樣性研究目前卻少見報(bào)道。

鑒于此，本研究基于16S RNA V4測(cè)序分析，揭示白云巖喀斯特微生物群落結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。同時(shí)，利用PICRUSt算法預(yù)測(cè)微生物群落功能基因組，初步解析白云巖喀斯特土壤微生物功能，以期為白云巖喀斯特土壤微生物群落結(jié)構(gòu)監(jiān)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實(shí)驗(yàn)的11個(gè)土壤樣品均采自施秉白云巖喀斯特地區(qū)，每個(gè)土壤樣點(diǎn)直線相隔距離大于200 m，每個(gè)樣點(diǎn)由1 m2內(nèi)5點(diǎn)取樣混合收集土壤樣品，4 ℃冰箱運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室，后置于-80 ℃冰箱中凍存。

1.2 微生物總DNA的提取

稱取土壤樣品0.5 g，用PowerSoil DNA Isolation Kit 試劑盒提取宏基因組DNA，使用方法參見說明，提取后的DNA于-80 ℃冰箱中凍存。

1.3 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析

以提取的宏基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增16S rRNA V4區(qū)及ITS1區(qū)，利用Illumina平臺(tái)高通量測(cè)序。測(cè)序下機(jī)數(shù)據(jù)在QIIME[13]軟件平臺(tái)進(jìn)行質(zhì)量控制分析，過濾除去低質(zhì)量及有嵌合體序列，然后進(jìn)行合并。利用Ucluster算法[14]進(jìn)行同源聚類，相似度≥97%的序列劃為OTUs。然后基于Rdp算法[15]根據(jù)Greengene數(shù)據(jù)庫[16]進(jìn)行分類注釋。利用R的Vegan、Ggplots等軟件包分析土壤微生物群落的α-多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)及ACE)及稀釋曲線。統(tǒng)計(jì)分析土壤微生物群落各分類水平的相對(duì)豐度，繪制微生物群落分類樹。根據(jù)皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析土壤性質(zhì)與土壤微生物群落的相互關(guān)系。

1.4 土壤微生物基因功能預(yù)測(cè)

利用Picrust[17]算法，基于KEGG數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)白云巖喀斯特土壤微生物功能基因組，基于皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析土壤性質(zhì)與土壤微生物功能之間的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品測(cè)序分析

本研究針對(duì)施秉白云巖喀斯特地區(qū)采集的11個(gè)土壤樣品提取宏基因組DNA；基于Illumina平臺(tái)，對(duì)16S rRNA V4區(qū)及ITS1區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序；并對(duì)測(cè)序下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)控處理，以97%的序列相似度作為分類閾值，對(duì)OTUs聚類。共獲取901 320條16S rRNA V4 序列及684 488條ITS1序列，測(cè)序數(shù)據(jù)平均有效率分別為95.65%(±0.94)和90.11%(±2.58)。測(cè)序數(shù)據(jù)的有效率都高于90%，測(cè)序數(shù)據(jù)較好且可靠，細(xì)菌16S rRNA V4區(qū)測(cè)序數(shù)據(jù)效率較高于真菌ITS1區(qū)。OTUs聚類表明，有效序列聚類后分別獲得6 387個(gè)和3 664個(gè)OTUs。繪制稀釋曲線(見圖1)，由圖1可見：在該深度測(cè)序下，測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，可以基本覆蓋到樣品中的絕大多數(shù)微生物物種，能夠很好的反映出樣品中微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性。

圖1 稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of observed species number

2.2 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)

2.2.1 細(xì)菌物種注釋

在各分類水平上對(duì)樣品進(jìn)行物種注釋分析，構(gòu)建細(xì)菌分類樹，以直觀展現(xiàn)出細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)組成。如圖2所示，在門的水平上，相對(duì)豐度高于1%的優(yōu)勢(shì)菌門主要包括：變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、厚壁菌門(Firmicutes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、消化螺旋菌門(Nitrospirae)、綠彎菌門(Chloroflexi)、疣微菌門(Verrucomicrobia)以及Latescibacteria共11個(gè)菌門。其中主要的優(yōu)勢(shì)菌門是：變形菌門(33.5%±2.8)、酸桿菌門(18.4%±1.5)、放線菌門(16.6%±1.9)，其物種組成和多樣性也最高。細(xì)菌基于科的水平上進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，豐度高于1%的共有11個(gè)：分別是鞘脂單胞菌科(Sphingomonadaceae)1.5%、黃單胞菌科(Xanthomonadaceae)1.2%、叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)1.6%、亞硝化單胞菌科(Nitrosomonadaceae)1.7%、RB41 1.6%、Gaiellaceae 1.5%、乳桿菌科(Lactobacillaceae)1.5%、毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)1.1%、浮霉?fàn)罹?Planctomycetaceae)2.5%、芽單胞菌科(Gemmatimonadaceae)3.0%和0319-6A21 2.5%，它們來自于8個(gè)菌門。在白云巖喀斯特土壤細(xì)菌群落中，含量豐度最高的是鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas, 1.5%)、Gaiella (1.5%) 和乳桿菌屬(Lactobacillus, 1.5%)。

2.2.2 真菌群落結(jié)構(gòu)分析

由圖3可知：基于門的分類水平分析，白云巖喀斯特土壤真菌群落主要包含4個(gè)菌門：子囊菌門、壺菌門(Chytridiomycota)、擔(dān)子菌門和接合菌門。其豐度依次為53.2%±4.8、2.4%±0.7、18.2%±3.1、25.1%±3.5，其中以子囊菌門豐度最高，其物種組成也最為豐富，多樣性也最高。在所有的真菌群落中，豐度前5的科為：被孢霉科(Mortierellaceae)10.1%、(Archaeorhizomycetaceae)5.8%、叢赤殼科(Nectriaceae)4.7%、傘菌科(Agaricaceae)3.9%和(Trichosporonaceae)3.3%。白云巖喀斯特土壤真菌主要包括尾柄孢殼菌屬(Cercophora)1.0%、鐮刀菌屬(Fusarium)1.1%、枝孢菌屬(Cladosporium)1.2%、花頂孢酶屬(Idriella)1.3%、葡萄孢屬(Botrytis)1.3%和(Lycogalopsis) 3.9%的菌群。

注: 相對(duì)豐度高于1%的物種。圖2 細(xì)菌分類樹Fig.2 Taxtree of bacteria

2.2.3 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性指數(shù)作為樣品中物種組成研究的重要指標(biāo)，也是一種最基本的多樣性研究指數(shù)。由表1可見：表明白云巖喀斯特土壤微生物中細(xì)菌的α-多樣性指數(shù)均高于真菌的，說明喀斯特土壤中的細(xì)菌群落多樣性高于真菌。

表1 Alpha多樣性指數(shù)Tab.1 The diversity index of Alpha

2.3 土壤微生物群落與土壤性質(zhì)的關(guān)系

利用Mantel test分析白云巖喀斯特土壤微生物群落與土壤性質(zhì)之間的相關(guān)性。結(jié)果表明(見圖4)：在白云巖喀斯特土壤中，土壤微生物群落與土壤性質(zhì)之間顯著相關(guān)(P=0.034,P=0.041)。進(jìn)一步利用皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析不同門類微生物群落與土壤性質(zhì)之間的相互關(guān)系，結(jié)果顯示(見圖4)：13個(gè)細(xì)菌門類都與土壤交換鎂(Emg2+)存在相關(guān)性。其中，有10個(gè)門類與其表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)關(guān)系，特別是Hydrogenedentes、螺旋體門(Spirochaetes)、黏膠球形菌門(Lentisphaerae)與Emg2+之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。而放線菌門、消化螺旋菌門則與Emg2+之間呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。真菌門類與Emg2+之間并未表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性。Hydrogenedentes不僅與Emg2+之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，還與pH顯著負(fù)相關(guān)。此外，綠菌門(Chlorobi)和柔膜菌門(Tenericutes)也和pH呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。嗜熱絲菌門(Caldiserica)、擔(dān)子菌門與其則是顯著正相關(guān)。在與土壤總鉀(TK)存在相關(guān)關(guān)系的微生物群落中，有5個(gè)菌群門類與其存在顯著的相關(guān)性。其中，與TK存在顯著正相關(guān)的菌群是疣微菌門和酸桿菌門；而TM6、Gracilibacteria和變形菌門與TK之間則是顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。Hydrogenedentes、綠菌門和柔膜菌門與pH呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，卻與土壤交換鈣(ECa2+)之間顯著正相關(guān)。此外，綠菌門與土壤有機(jī)碳(SOC)、土壤總磷(STP)，接合菌門與ECa2+、STP均為顯著正相關(guān)關(guān)系。而嗜熱絲菌門與ECa2+，擔(dān)子菌門與ECa2+、STP之間則表現(xiàn)為顯著的負(fù)相關(guān)。此外，由圖4還可知，細(xì)菌門類均與Emg2+存在相關(guān)性，且大多數(shù)門類與其呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，而ECa2+卻與之相反，大多微生物群落與其呈正相關(guān)關(guān)系。

注: 相對(duì)豐度高于1%的物種。圖3 真菌分類樹Fig.3 Taxtree of fungi

注:*代表顯著性相關(guān),下同。圖4 土壤性質(zhì)與微生物群落之間的相關(guān)性Fig.4 The relativity between soil property and microbial community

2.4 土壤性質(zhì)與細(xì)菌代謝功能之間的相互作用

2.4.1 PICRUSt基因預(yù)測(cè)

PICRUSt使用原理在于根據(jù)微生物群落的分類信息及微生物群落的豐度數(shù)據(jù)，利用數(shù)據(jù)庫分析，預(yù)測(cè)生物群落的功能基因組。本研究通過Picrust算法，基于KEGG數(shù)據(jù)庫，對(duì)白云巖喀斯特土壤微生物基因功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)。結(jié)果共預(yù)測(cè)出6 208個(gè)同源功能基因(KEGG orthology)，富集于311條代謝通路(pathway)(見圖5)。環(huán)境信息處理通路中的膜轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)通路上富集的基因數(shù)量最高。有關(guān)代謝的基因在種類和數(shù)量上，都占據(jù)著預(yù)測(cè)功能基因中的主要地位；其中，有關(guān)氨基酸代謝和碳水化合物代謝的通路在富集基因數(shù)量上也占絕對(duì)顯著優(yōu)勢(shì)，推測(cè)認(rèn)為在喀斯特土壤中大量細(xì)菌進(jìn)行著活躍的生長代謝活動(dòng)。

圖5 預(yù)測(cè)功能基因Fig.5 Predicting functional genes

2.4.2 代謝通路與土壤性質(zhì)的相關(guān)性分析

在探究了土壤微生物群落與土壤性質(zhì)的相關(guān)性之后，本研究進(jìn)一步對(duì)代謝通路與土壤性質(zhì)的相關(guān)性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明(見圖6)：在白云巖喀斯特土壤中，土壤微生物代謝通路與土壤性質(zhì)顯著相關(guān)。土壤中的ECa2+、SOC、STP、TK、pH以及Emg2+都與代謝通路、基因信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞進(jìn)程4個(gè)方面存在相關(guān)性。尤其以與代謝通路之間的相關(guān)性最為顯著。其中，Emg2+對(duì)代謝通路的影響最為廣泛，同時(shí)代謝通路與Emg2+的相關(guān)性也最為顯著。包括43條與Emg2+呈正相關(guān)的代謝通路(31條顯著正相關(guān)，如精氨酸和脯氨酸代謝、D-丙氨酸代謝、丙酮酸代謝等與之的相關(guān)性)；13條代謝通路與之呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(2條顯著負(fù)相關(guān))。表明在白云巖喀斯特土壤高鎂的條件下，大量微生物代謝活動(dòng)十分活躍。此外，pH作為土壤檢測(cè)中的一項(xiàng)重要的理化指標(biāo)，其與代謝通路仍有著密切的相關(guān)性。在本研究中，僅有苯丙素的生物合成(phenylpropanoid biosynthesis)、GPI-anchor生物合成等7條代謝通路與土壤pH呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，其余52條代謝通路均與pH之間存在正相關(guān)關(guān)系。即隨著pH值的增加，大量菌群的代謝活動(dòng)也隨之更加活躍。TK和STP與大多土壤微生物的代謝通路的相關(guān)性并不是很高。僅有類黃酮生物合成、青霉素和頭孢菌素生物合成、半乳糖代謝等13條代謝通路與TK顯著正相關(guān)。甜菜色素的生物合成、吲哚生物堿生物合成等6條代謝通路與STP呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。較之代謝通路與pH和Emg2+的相關(guān)性，代謝通路與SOC和ECa2+之間主要存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。存在18條與SOC顯著負(fù)相關(guān)的代謝通路；代謝通路與ECa2+間基本呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，僅有GPI-anchor生物合成和線粒體中脂肪酸鏈延長兩通路與其正相關(guān)。而這兩代謝通路與Emg2+間卻是負(fù)相關(guān)。此外，丁酰苷菌毒與新霉素的生物合成、二苯乙烯類、庚酮類和姜酚的生物合成、青霉素和頭孢菌素的生物合成、三羧酸循環(huán)、醚脂類代謝、嘧啶代謝6條代謝通路均與pH、Emg2+、TK、STP正相關(guān)，與SOC和ECa2+負(fù)相關(guān)。除此之外，Emg2+與環(huán)境信息處理、基因信息處理等通路之間的相關(guān)性也主要表現(xiàn)為正相關(guān)。說明在白云巖喀斯特地區(qū)，土壤高鎂的條件下，土壤微生物在代謝、環(huán)境信息處理、基因信息處理等方面十分活躍。但對(duì)于其具體的作用機(jī)制，仍需進(jìn)一步深入研究。

圖6 土壤性質(zhì)與代謝通路之間的相關(guān)性分析Fig.6 The relativity between soil property and metabolic pathway

3 討論

土壤中微生物類群數(shù)量十分龐大，且土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜。本研究中，相對(duì)豐度在1%以上的細(xì)菌門類有11個(gè)，以變形菌門(33.5%±2.8)、酸桿菌門(18.4%±1.5)和放線菌門(16.6%±1.9)豐度為最高。Liu等[18]基于Illumina平臺(tái)，對(duì)櫻桃果園中土壤微生物群落比較分析中顯示，豐度最高的同為以上3個(gè)門類(變形菌門相對(duì)豐度為40.11%～63.72%，酸桿菌門相對(duì)豐度為4.02%～11.29%，放線菌門相對(duì)豐度為6.63%～13.00%)。此外，豐度在1%以上的還有TM7、厚壁菌門、疣微菌門、擬桿菌門和芽單胞菌門。與Liu等[18]相比較，本研究中的變形菌門豐度低于其櫻桃果園土壤中變形菌門的豐度，而酸桿菌門和放線菌門則比其高。除TM7以外，其它幾個(gè)主要的菌群門類豐度，都與本研究保持一致。此外，在Liu等[18]研究中，綠彎菌門、消化螺旋菌門以及浮霉菌門相對(duì)豐度都是低于1%，而在本研究中，以上3個(gè)菌群相對(duì)豐度則是高于1%。另外，將本研究中白云巖喀斯特土壤細(xì)菌群落與果園耕作土比較發(fā)現(xiàn)，2組之間的細(xì)菌群落豐度有的存在差異，有的豐度卻接近。如：Duan等[19]對(duì)喀斯特石漠化地區(qū)桑樹根際土壤微生物研究中，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌中主要優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門、放線菌門和異常球菌-棲熱菌門(deinococcus-Thermus)，與本研究中的主要優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門、酸桿菌門、放線菌門存在一定的差異?？梢姡λ固厥貐^(qū)桑樹根際土壤細(xì)菌群落與喀斯特白云巖土壤細(xì)菌群落存在一定差異。這可能是植物根系對(duì)于根際微生物群落結(jié)構(gòu)有影響，其根際微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異性[20]。為此，筆者推測(cè)地表植被與整個(gè)土壤微生物群落的分布相關(guān)。

高通量測(cè)序法的出現(xiàn)，所檢測(cè)到的菌群數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過預(yù)期的估計(jì)。戴雅婷等[21]基于高通量測(cè)序，對(duì)不同植被恢復(fù)類型下土壤微生物多樣性進(jìn)行了分析。牛世全等[22]基于IlluminaMiseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)鹽堿土壤微生物多樣性進(jìn)行了分析。Lauber等[23]首次利用高通量測(cè)序法將取自美國從北到南的88個(gè)土壤樣品進(jìn)行測(cè)序，同時(shí)基于宏觀的角度，探究了細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)組成，并發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的群落組成多樣性與其群落結(jié)構(gòu)系統(tǒng)發(fā)育和土壤的pH存在顯著的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)可達(dá)到0.79和0.71。本研究也證明了土壤微生物群落與pH之間存在相關(guān)性。此外，還有研究證明：土壤微生物生物量、微生物熵以及土壤基礎(chǔ)呼吸作用均隨著土壤pH值的降低而顯著下降[24]。因此，在探究影響土壤微生物群落多樣性的研究中，pH應(yīng)作為重要環(huán)境因子而被關(guān)注。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，大部分微生物群落與Emg2+間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明微生物群落多樣性的降低與喀斯特高鎂的自然環(huán)境存在相關(guān)性，但目前還沒有太多相關(guān)的研究來揭示其作用機(jī)理。

Picrust基因功能預(yù)測(cè)，作為一種新興的研究手段，將不可視的微生物與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比，進(jìn)而預(yù)測(cè)基因功能。本研究表明，在白云巖喀斯特地區(qū)存在微生物攜帶大量與代謝有關(guān)的基因?？梢?，微生物的代謝活動(dòng)較為活躍。此外，土壤環(huán)境因子與代謝通路間存在相關(guān)性。特別是Emg2+與代謝通路間的相關(guān)性尤為顯著。但目前并沒有太多與該研究方向相關(guān)的文獻(xiàn)資料，因此，對(duì)其作用機(jī)制仍不明確，這也是后續(xù)研究亟待解決的問題。此外，PICRUSt基因功能預(yù)測(cè)在腸道微生物多樣性研究中[25-27]也得到了廣泛的應(yīng)用，可作為將來一種常用的微生物研究方法。

本研究基于高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，分析微生物群落結(jié)構(gòu)，其數(shù)據(jù)深度能較好且全面的覆蓋白云巖喀斯特土壤微生物，對(duì)于后續(xù)的白云巖喀斯特土壤微生物研究能提供數(shù)據(jù)支持。同時(shí)，基于Picrust算法預(yù)測(cè)獲得的白云巖喀斯特土壤微生物功能基因組，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了土壤性質(zhì)不僅與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)有關(guān)，與微生物群落的代謝也相關(guān)，可為白云巖喀斯特土壤微生物群落的代謝研究提供新的研究方向。