李玲玲

(重慶工貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物化學(xué)工程系，重慶 涪陵 408000)

0 引言

揮發(fā)油類又稱精油，是一類具有揮發(fā)性可隨水蒸氣蒸餾出來的油狀液體，大部分具有香氣。青蒿精油含有豐富的單萜和倍半萜類，是一種具有藥用價值的副產(chǎn)品[1]。現(xiàn)代研究證明青蒿揮發(fā)油具有抗菌、抗癌、抗病毒、抗炎、驅(qū)蚊、殺蟲、抗氧化等活性[2]。主要用途有治療痤瘡、抑制流感病毒、消炎、抗?jié)?、局部刺激和強心、解熱、止咳、祛痰、平喘和?zhèn)痛，并能作為保健食品[3]，還可用于研制驅(qū)蚊貼[4]。

揮發(fā)油的提取方法主要有4種：蒸餾法、溶劑提取法、壓榨法、二氧化碳超臨界流體提取法，其中蒸餾法又分為水蒸氣蒸餾法和直接蒸餾法[5]。影響青蒿揮發(fā)油提取含量的因素有提取方法、生長采收期、貯存期、產(chǎn)地、部位等[6]。李春紅等[7]測定了5月至10月青蒿揮發(fā)油的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)青蒿揮發(fā)油的含量隨生長期的延長逐漸增高，9月份盛花期含量最高。青蒿不同部位揮發(fā)油收率花>葉>莖、根，甘肅慶陽產(chǎn)青蒿莖和葉揮發(fā)油收率分別為2.8%和9.7%[6,8]。Yinta Li等[9]采用二氧化碳超臨界流體提取青蒿精油，原油收率達(dá)到了11.17%。

本研究以重慶涪陵地區(qū)9～10月青蒿植株的葉和花作為材料，采用水蒸氣蒸餾法提取其中的揮發(fā)油，測定揮發(fā)油的抑菌活性。為青蒿揮發(fā)油在抑菌領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：重慶市涪陵地區(qū)9～10月青蒿植株的葉和花。

抑菌試驗指示菌：細(xì)菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CICC 10384、大腸埃希菌(Escherichiacoli)CICC 23657、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)CICC 10275，均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。真菌：黑曲霉(Aspergillusniger)CICC 2487、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CICC 33032均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基。

試劑：無水乙醚(分析純、成都市科隆化學(xué)品有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

輕油揮發(fā)油測定器(安徽科騰實驗設(shè)備有限公司)、CL-2型恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)、智能MHP-250型霉菌培養(yǎng)箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)、DNP-9272A型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海將任實驗設(shè)備有限公司)、LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)、SW-CJ-1FD型超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 材料的準(zhǔn)備

將采集的青蒿除去殘莖及無用部位，將留下的葉子和花蕾洗凈，濾干水分。

1.3.2 精油的提取

準(zhǔn)確稱取一定量的青蒿葉和花，室溫下置蒸餾水中浸泡一段時間后，參照2015年版《中國藥典》(四部)揮發(fā)油測定法(甲法)提取青蒿精油[10]。

精油的得率按照下式計算：精油得率=揮發(fā)油體積/青蒿質(zhì)量×100%

(1)

1.4 單因素實驗

考察浸泡時間、料液比、蒸餾時間3個因素對青蒿精油提取量的影響，每個因素取3個水平。

1.5 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以浸泡時間、料液比和蒸餾時間為自變量，以精油得率為評價指標(biāo)，設(shè)計了3因素3水平正交試驗，探討精油最佳提取工藝。

1.6 抑菌試驗

以5種代表性的指示菌金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、釀酒酵母來檢測青蒿精油的抑菌活性，這5種指示菌中既有革蘭氏陽性菌，也有革蘭氏陰性菌；既有細(xì)菌，也有真菌。

1.6.1 供試菌液的制備

利用牛肉膏蛋白胨斜面活化3 種供試細(xì)菌菌株，利用PDA培養(yǎng)基活化酵母和黑曲霉，收集對數(shù)生長期的菌于生理鹽水中(黑曲霉收集的是孢子)，制成含量約為1×107cfu/mL的供試菌液，備用[11]。

1.6.2 抑菌圈直徑的測定

采用濾紙片擴散法測定揮發(fā)油的抑菌效果。濾紙片浸透揮發(fā)油：揮發(fā)油與無水乙醚按1∶1體積比混勻。用打孔器將濾紙制作成直徑為6 mm的濾紙片，滅菌后烘干，浸泡于揮發(fā)油溶液中30 min，使之充分吸收，瀝干。

接種、涂布指示菌：用移液槍分別吸取100 μL制備好的供試菌液，加在相應(yīng)的平板上(3種指示細(xì)菌加在牛肉膏蛋白胨平板上，真菌加在PDA平板上)，用涂布棒涂布均勻。

貼濾紙片：用鑷子夾取3張濾紙片，呈“品”字形貼于相應(yīng)的加有指示菌的平板上。另外放1片只浸有乙醚的濾紙片作為空白對照，每組實驗重復(fù)2次[12]。

培養(yǎng)：置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(細(xì)菌在37 ℃下培養(yǎng)24 h，真菌在28 ℃下培養(yǎng)48～72 h)，測定抑菌圈直徑。

1.6.3 最低抑菌濃度(MIC)的測定

采用倍比稀釋法測定揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、釀酒酵母的MIC，進(jìn)一步檢測青蒿精油的抑菌程度。

液體培養(yǎng)基倍比稀釋揮發(fā)油：將滅菌后的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(測細(xì)菌MIC)或馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基(測真菌MIC)分裝于7支試管中，第1管1.2 mL，其余各管1 mL。用移液槍吸取0.8 mL的青蒿精油于第1支試管內(nèi)，蓋上試管塞，混勻后吸出1 mL至第2支試管中，混勻再吸取1mL至第3支試管中，以此類推，直至第7管，從第7管中吸出1 mL棄去。稀釋后，第1管至第7管中揮發(fā)油的體積分?jǐn)?shù)依次為：400 μL/mL、200 μL/mL、100 μL/mL、50 μL/mL、25 μL/mL、12.5 μL/mL、6.25 μL/mL。同時設(shè)置對照，對照一：在1 mL培養(yǎng)基中只加入30 μL青蒿精油；對照二：在含 1 mL培養(yǎng)基的試管中，只加入30 μL指示菌液。

接種指示菌液：在含不同體積分?jǐn)?shù)青蒿精油的試管(1～7號管)及對照二的試管中，分別加入1.6.1制備的供試菌液30 μL，充分混勻。(此時1～7號管中揮發(fā)油的體積分?jǐn)?shù)分別為：388.3 μL/mL、194.2 μL/mL、97.1 μL/mL、48.5 μL/mL、24.3 μL/mL、12.2 μL/mL、6.1 μL/mL)

培養(yǎng)：將上述各試管放入搖床振蕩培養(yǎng)，接種了3種指示細(xì)菌的試管在36 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)24 h；接種了釀酒酵母和黑曲霉的試管在28 ℃、150 r/min的條件下分別培養(yǎng)48 h和72 h。

檢查：取出試管，逐個檢查各試管的渾濁度。對照一完全透明、對照二渾濁，說明試驗結(jié)果有效。其它各試管與對照一透明度一樣，表明指示菌的生長被抑制；渾濁則說明有指示菌生長。取完全無指示菌生長的最低揮發(fā)油濃度為最低抑菌濃度(MIC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 青蒿精油的性狀

青蒿精油為淡黃色的透明液體，有特異氣味，隨蒸餾時間延長，黃色程度會逐漸加深。

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 料液比對青蒿精油提取的影響

稱取粉碎的青蒿葉30 g，置于500 mL圓底燒瓶中，固定蒸餾時間為4 h，浸泡時間為0 h，分別以料液比1∶7、1∶8、1∶9(質(zhì)量體積比)進(jìn)行精油的提取，研究料液比對青蒿葉和花中精油提取的影響，確定最佳料液比。結(jié)果見表1。

表1 料液比對青蒿精油提取的影響Tab.1 Effect of ratio of material to liquid on extraction of Artemisia annua essential oil

由表1可以看出，隨著料液比的增加，精油得率先增加，后減少。這可能是因為水分過少(料液比為1∶7)時不能充分浸潤物料，導(dǎo)致提取不完全；水分過多時(料液比1∶9)，精油在水中的溶解度增加，導(dǎo)致提取的精油減少。因此最佳料液比為1∶8。

2.2.2 蒸餾時間對青蒿精油提取的影響

稱取粉碎的青蒿葉30 g，置于500 mL圓底燒瓶中，固定浸泡時間為0 h，料液比為1∶8，分別蒸餾1 h、2 h、3 h進(jìn)行精油的提取，研究蒸餾時間對青蒿葉和花中精油提取的影響，確定最佳蒸餾時間。結(jié)果見表2。

表2 蒸餾時間對青蒿精油提取的影響Tab.2 Effect of distillation time on extraction of Artemisia annua essential oil

由表2可以看出，1～2 h隨著蒸餾時間的增加，精油得率逐漸增加；2～3 h隨著蒸餾時間的增加，精油得率降低。這可能是由于2 h時精油已經(jīng)提取完全，繼續(xù)延長蒸餾時間，由于精油的易揮發(fā)性，導(dǎo)致提取出的精油揮發(fā)損失了一部分，從而導(dǎo)致精油的得率下降。另外隨著蒸餾時間的延長，青蒿精油的顏色由淡黃色逐漸變深。因此最佳的蒸餾時間為2 h。

2.2.3 浸泡時間對青蒿精油提取的影響

稱取粉碎的青蒿葉30 g，置于500 mL圓底燒瓶中，固定蒸餾時間為4 h，料液比1∶8，分別以浸泡時間為0 h、1.5 h、3 h進(jìn)行精油的提取，研究浸泡時間對青蒿葉和花中精油提取的影響，確定最佳浸泡時間。結(jié)果表3。

表3 浸泡時間對青蒿精油提取的影響Tab.3 Effect of soaking time on extraction of Artemisia annua essential oil

由表3可以看出，0～1.5 h隨著浸泡時間的增加，青蒿精油的得率逐漸增加，1.5～3 h，隨著浸泡時間的增加，精油得率不再變化。因此最佳浸泡時間為1.5 h。

2.3 正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，每一單因素分別選取3個水平進(jìn)行正交試驗，正交試驗設(shè)計見表4。分別取青蒿葉和花30 g，按照表5中的1～9號處理進(jìn)行青蒿精油的提取，以得率為指標(biāo)，進(jìn)行直觀分析，結(jié)果見表5。用SPSS Statistics 17.0軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表6。

表4 正交試驗因素水平表Tab.4 Level table of factors for orthogonal test

表5 正交試驗結(jié)果Tab.5 Orthogonal test results

表6 提取工藝對青蒿精油得率影響的方差分析Tab.6 Variance analysis of influence of extraction process on the yield of Artemisia annua essential oil

由表6可以看出，影響青蒿精油得率的主次順序為A>B>C，即浸泡時間>蒸餾時間>料液比。青蒿精油的最佳提取工藝條件為A2B3C2，即浸泡時間1.5 h，蒸餾時間為3 h，料液比為1∶8。由表6可以看出，各因素的水平變化對青蒿精油得率均無顯著影響。

2.4 青蒿精油對指示菌的抑菌效果

通過濾紙片法測定青蒿精油(體積濃度為500 μL/mL)對5種指示菌的抑菌效果，結(jié)果表明青蒿精油對5種指示菌均有一定的抑菌效果，結(jié)果見圖1和表7。

表7 青蒿精油對5種指示菌的抑菌圈大小Tab.7 Antimicrobial circle size of Artemisia annua essential oil to five indicators

注：a)金黃色葡萄球菌；b)大腸埃希菌；c)枯草芽孢桿菌；d)黑曲霉；e)釀酒酵母。圖1 青蒿精油對5種指示菌的抑菌效果Fig.1 Antimicrobial effect of Artemisia annua essential oil on five indicatorsNote:a)Staphylococcus aureus;b)Escherichia coli;c)Bacillus subtilis;d)Aspergillus niger;e)Saccharomyces cerevisiae

采用液體稀釋法測定青蒿精油對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、釀酒酵母的MIC，結(jié)果見表8。

表8 青蒿精油對5種指示菌的MIC測定結(jié)果Tab.8 MIC determination of Artemisia annua essential oil for five indicators

從表8中可以看出，青蒿精油對細(xì)菌中的金黃色葡萄球菌抑菌效果最好，MIC為48.5 μL/mL。對真菌中的釀酒酵母抑菌效果最好，MIC為48.5 μL/mL。

3 討論與結(jié)論

考慮環(huán)境污染及生產(chǎn)實際等多方面因素對試驗造成的影響，本研究選擇水作為提取溶劑。選擇揮發(fā)油測定器作為收集器，由于水的密度大于青蒿的精油的密度，提取中水相位于餾出液的下層。在測定最低抑菌濃度時，比較了濾紙片法和液體培養(yǎng)基倍比稀釋揮發(fā)油法的測定效果，發(fā)現(xiàn)液體培養(yǎng)基倍比稀釋法測定最低抑菌濃度的效果更好，通過液體培養(yǎng)基是否渾濁更容易判斷揮發(fā)油的抑菌程度。

本研究得到了青蒿葉和花蕾中精油提取的最佳工藝：浸泡時間為1.5 h，蒸餾時間為3 h，料液比為1∶8。提取出的青蒿精油對5種指示菌(金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、釀酒酵母)均有一定的抑菌活性，其中對金黃色葡萄球菌和釀酒酵母的抑菌效果最好，MIC均為48.5 μL/mL。