李西鵬，張 濤

（華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院，激光生命科學(xué)研究所教育部重點(diǎn)實驗室，廣州510631）

光動力治療（photodynamic therapy）是一種光激活的在臨床上非常有前景的癌癥治療方式[1-3]。在光動力治療過程中，光敏劑在特定波長的激光照射下被激活，生成活性很強(qiáng)的活性氧物種（reactive oxygen species，ROS），如單線態(tài)氧，其能與附近生物大分子發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生細(xì)胞毒性，進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞[4-7]。然而，ROS 的半衰期很短（<40 ns），并且只能在生成部位附近起作用（<20 nm），這比整個細(xì)胞的尺寸小得多[8-11]。因此，將光敏劑遞送至對ROS敏感的細(xì)胞器將有望改善光動力治療的效果。

細(xì)胞是生物體的基本功能單元，而細(xì)胞器則是細(xì)胞功能正常運(yùn)行不可缺失的部分。真核細(xì)胞的細(xì)胞器主要包括細(xì)胞核、線粒體、溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等。只有每種細(xì)胞器各司其職，協(xié)助細(xì)胞完成正常的生理功能，生命才能得以存在和延續(xù)。因此，細(xì)胞器被認(rèn)為是光動力治療的重要靶標(biāo)。設(shè)計不同細(xì)胞器的靶向光敏劑能增強(qiáng)光敏劑在細(xì)胞器的聚集，有助于提高光動力治療的療效，減少毒副作用。本文主要聚焦細(xì)胞器靶向光敏劑的實現(xiàn)策略的研究現(xiàn)狀，并希望為以后構(gòu)建新的靶向型光敏劑提供參考。

1 細(xì)胞核靶向光敏劑

眾所周知，細(xì)胞核是細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)儲存、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄的場所,在細(xì)胞的代謝、生長和分化中起著重要的作用[12-13]。細(xì)胞核是高度分化的細(xì)胞器，具有雙層磷脂膜，核膜上的核孔復(fù)合體（nuclear pore complexes，NPCs）是物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核的唯一通道?，F(xiàn)階段細(xì)胞核靶向主要利用穿膜肽（transcriptional activator protein，TAT）和核定位序列（nuclear localization sequence，NLS）來實現(xiàn)。

1.1 TAT

Yu等[14]合成了1種基于上轉(zhuǎn)換納米粒子（upconversion nanoparticles，UCNPs）的細(xì)胞核靶向雙光敏劑 NaFY4:Yb,Er,Tm@TiO2-Chlorin e6-TAT（UCNPs@TiO2-Ce6-TAT）。UCNPs的激發(fā)光為980 nm，發(fā)射光為362 nm和655 nm，這2種波長的發(fā)射光分別被 TiO2和二氫卟吩 e6（chlorin e6，Ce6）吸收并產(chǎn)生多種ROS。利用TAT將納米顆粒轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，使ROS在核內(nèi)積累。細(xì)胞核中大量ROS的積累會破壞DNA雙鏈導(dǎo)致細(xì)胞死亡（圖1）。

圖1 核靶向雙光敏劑UCNPs@TiO2-Ce6-TAT在980 nm近紅外激光激發(fā)下產(chǎn)生多種ROS并誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂的示意圖[14]Fig.1 Schematic illustration of the synthetic process of the nuclear targeted dual-photosensitizer UCNPs@TiO2-Ce6-TAT,multiple ROS generation under a single 980 nm NIR laser excitation and inducing DNA double strand breaks[14]

1.2 NLS

Cheng等[15]制備了自傳遞嵌合肽納米棒（self-delivery chimeric peptide nanorods，pnPNP），用于質(zhì)膜和核靶向的光敏劑傳遞。嵌合的肽[C16K(PpIX)PKK KRKVPEG8]由用于質(zhì)膜靶向的疏水烷基鏈(C16)、光敏劑原卟啉（protoporphyrin IX，PpIX）、核定位序列PKKKRKV和一個親水的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）鏈組成。質(zhì)膜靶向pnPNP可直接誘導(dǎo)細(xì)胞壞死，增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性，從而改善細(xì)胞攝取。隨后，光誘導(dǎo)的內(nèi)源/溶酶體破壞，促進(jìn)了pnPNP的溶酶體逃逸。在NLS肽的參與下，具有正表面電荷自組裝的納米棒pnPNP能夠定位于細(xì)胞核。細(xì)胞核內(nèi)產(chǎn)生的ROS將對DNA鏈造成顯著的氧化損傷（圖 2）。

圖2 pnPNP用于質(zhì)膜和核靶向光動力治療的原理圖[15]Fig.2 Schematic illustration of pnPNP for plasma membrane and nucleus targeted photodynamic therapy[15]

2 線粒體靶向光敏劑

線粒體作為至關(guān)重要的細(xì)胞器在細(xì)胞能量的產(chǎn)生和細(xì)胞的程序性死亡過程中起著關(guān)鍵的作用[16-17]。因此，線粒體被認(rèn)為是光動力治療腫瘤的重要靶標(biāo)，增強(qiáng)光敏劑在線粒體部位的聚集將有助于提高光動力治療的療效。

目前，實現(xiàn)光敏劑靶向線粒體的策略主要有3種：一是離域親脂性陽離子（delocalized lipophilic cation，DLC）靶向；二是線粒體靶向肽策略；三是構(gòu)建納米載體。其中三苯基膦（triphenylphosphine，TPP）是最典型的、應(yīng)用最廣泛的線粒體靶向配體，主要是因為其結(jié)構(gòu)簡單，能與光敏劑末端連接且不破壞光敏劑。這里主要介紹基于TPP的2種納米載體負(fù)載光敏劑的策略。

2.1 有機(jī)線粒體靶向納米載體負(fù)載光敏劑

有機(jī)納米載體具有載運(yùn)效率高、體內(nèi)循環(huán)周期短、生物毒性小和載藥種類多等獨(dú)特的優(yōu)勢，已在線粒體靶向光動力治療中被廣泛應(yīng)用。

Yue等[18]將TPP連在熱敏脂質(zhì)體上，并在脂質(zhì)體內(nèi)部裝載光敏劑IR-780和抗癌藥洛尼達(dá)明，構(gòu)建成線粒體靶向的熱敏型脂質(zhì)體（IR-780 and Lonidamine encapsulated mitochondria-targeting thermosensitive liposomes，IL-TTSL），用于靶向腫瘤線粒體光熱觸發(fā)的光熱-光動力-化學(xué)治療。在近紅外（near infrared，NIR）激光的照射下，IR-780引起局部溫度升高從而誘導(dǎo)洛尼達(dá)明的釋放，可用于化學(xué)治療，且局部的高溫還可用于光熱治療。同時IR-780在腫瘤線粒體中產(chǎn)生大量的ROS，實現(xiàn)了最大化的光動力治療（圖3）。

圖3 808 nm激光觸發(fā)線粒體靶向熱敏脂質(zhì)體IL-TTSL化療-光動力和光熱聯(lián)合療法的示意圖[18]Fig.3 Schematic illustration of the mitochondria-targeting thermosensitive liposomes IL-TTSL for chemo-,photodynamic and photothermal combined therapy triggered by 808 nm laser[18]

Guan等[17]將TPP與聚集誘導(dǎo)發(fā)光（aggregation-induced emission，AIE）聚合物相連，同時將上轉(zhuǎn)換納米粒子負(fù)載在其內(nèi)部，構(gòu)建成UCNP@PAIE-TPP NPs，解決了AIE光敏劑只能被紫外或可見光激活的問題（圖4）。在NIR激光的照射下，上轉(zhuǎn)換納米粒子發(fā)出上轉(zhuǎn)換熒光，并激活A(yù)IE聚合物在線粒體部位產(chǎn)生高水平的ROS。

圖4 pH響應(yīng)的UCNP@PAIE-TPP-PEG NP作為近紅外光觸發(fā)線粒體靶向光敏劑產(chǎn)生ROS用于光動力治療的示意圖[19]Fig.4 Schematic diagram of pH responsive UCNP@PAIETPP-PEG NPs as the NIR triggered mitochondria targeting photosensitizer to generate ROS for photodynamic therapy[19]

Yang等[20]設(shè)計合成了一種多步響應(yīng)性智能納米粒子（CAT@S/Ce6-CTPP/DPEG），該納米粒子具有如下優(yōu)勢：1）對pH敏感，并且響應(yīng)pH后會變成帶正電的顆粒，能夠增強(qiáng)腫瘤的內(nèi)吞作用，增加納米粒子在腫瘤部位的滯留時間；2）在腫瘤微酸環(huán)境的作用下，TPP暴露出來，從而使得納米粒子靶向線粒體；3）過氧化氫酶催化過氧化氫產(chǎn)生氧氣，克服了腫瘤缺氧問題，進(jìn)一步增強(qiáng)了光動力治療的療效；4）其與程序性死亡配體 1（programmed deathligand 1，PD-L1）抗體結(jié)合，還能抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移（圖5）。

圖5 智能納米反應(yīng)器用于pH響應(yīng)性腫瘤歸巢、線粒體靶向和增強(qiáng)型光動力免疫療法的示意圖[20]Fig.5 Schematic diagram of smart nanoreactors for pH-responsive tumor homing,mitochondria-targeting,and enhanced photodynamic-immunotherapy of cancer[20]

2.2 無機(jī)線粒體靶向納米載體負(fù)載光敏劑

無機(jī)納米載體通常具有適用于細(xì)胞遞送的通用特性，包括廣泛的可用性、豐富的功能、良好的生物相容性、靶向遞送的潛在能力和可控釋藥，表面還可進(jìn)行修飾擴(kuò)展其功能性?；谏鲜鰞?yōu)勢，無機(jī)納米載體在線粒體靶向光動力治療領(lǐng)域受到了廣泛的關(guān)注。

Yu等[21]將TPP修飾到負(fù)載TiO2的上轉(zhuǎn)換納米粒子UCNPs表面，用以靶向線粒體，在NIR激光照射下進(jìn)行光動力治療。在光動力治療的研究中，UCNPs@TiO2-NH2組在光照條件下僅能殺死30%的癌細(xì)胞，而修飾了TPP的UCNPs@TiO2-NH2組的腫瘤細(xì)胞抑制率達(dá)到90%，光動力治療效果顯著提升（圖 6）。

圖6 納米光敏劑（TPP錨定的UCNPs@TiO2納米顆粒）的結(jié)構(gòu)和ROS生成的示意圖[21]Fig.6 Schematic illustration of the structure of the nanophotosensitizer(TPP anchored UCNPs@TiO2nanoparticles)and ROS generation[21]

Yang 等[22]首先將聚多巴胺（polydopamine，PDA）負(fù)載到黑磷（black phosphorus，BP）上形成BP@PDA，然后將TPP和Ce6與BP@PDA相連，構(gòu)建成光療劑BP@PDA-Ce6&TPP NSs，用于線粒體靶向的光熱-光動力治療（圖7）。

圖7 BP@PDA-Ce6＆TPP NS的制備和治療功能的示意圖[22]Fig.7 Schematic illustration of the preparation and therapeutic functions of BP@PDA-Ce6&TPP NSs[22]

3 溶酶體靶向光敏劑

溶酶體是一種動態(tài)的、多態(tài)的、含水解酶的細(xì)胞器，具有接受和降解來自分泌、內(nèi)吞、自噬和吞噬膜轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的大分子的能力。溶酶體的功能取決于膜的完整性。溶酶體膜的受損（例如堿化或易位）會導(dǎo)致質(zhì)子和水解酶泄漏，從而引起細(xì)胞器功能障礙，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[23-25]。因此，設(shè)計靶向溶酶體的光敏劑，可以迅速引起溶酶體功能障礙。Li等[26]設(shè)計了一個雙碘取代的氟硼二吡咯（diiodo-substituted BODIPY，MBDP）（圖 8）作為光敏劑。試驗表明，在激光照射下，溶酶體特異性靶向的MBDP會破壞溶酶體的完整性，最終引起癌細(xì)胞凋亡。

圖8 溶酶體靶向光敏劑MBDP的結(jié)構(gòu)和光動力治療示意圖[26]Fig.8 Schematic diagram of the structure and photodynamic therapy of lysosomal targeting photosensitizer MBDP[26]

Niu等[27]設(shè)計了一種陽離子二萘嵌苯探針（cationic perylene probe，PC4）（圖 9）。該探針具有極好的水溶解性、高化學(xué)穩(wěn)定性、光穩(wěn)定性以及高效的單線氧產(chǎn)生能力。PC4能特異性靶向溶酶體，3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]試驗證明，PC4具有可忽略不計的暗毒性（IC50>500 mmol/L），并且在光照下，低劑量的PC4顯示出優(yōu)異的光毒性（IC50=2.8 mmol/L，4.2 J/cm2）。更重要的是，PC4在死細(xì)胞中從溶酶體向細(xì)胞核的移動為監(jiān)測和評估治療效果提供了一個有效的方法。

Zhou等[28]制備了Ru-Pt雙金屬雙光子超分子配位化合物（supramolecular coordination complexes，SCCs）（圖10）。由6個基于Ru（II）的光敏劑和4個基于Pt（II）的受體構(gòu)建成1個單分子超集合體中的嵌段，通過協(xié)調(diào)驅(qū)動自組裝形成八面體Ru-Pt，其具有深紅色發(fā)射、較大范圍的雙光子吸收和高效的ROS產(chǎn)生效率。形成的納米顆粒能選擇性在溶酶體中積累。在體試驗證明，使用Ru-Pt雙金屬的雙光子光動力治療具有顯著的抗腫瘤功效。

4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向光敏劑

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）是真核細(xì)胞中最大的細(xì)胞器，在多種細(xì)胞內(nèi)代謝功能中起著復(fù)雜而關(guān)鍵的作用，包括生物合成、傳感和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，特別是在蛋白質(zhì)折疊和翻譯后修飾中。許多刺激物可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，通過未折疊蛋白反應(yīng)以及Ca2+信號機(jī)制導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[29-31]。

圖9 溶酶體靶向光敏劑PC4的結(jié)構(gòu)、光動力治療和成像過程的示意圖[27]Fig.9 Schematic diagram of the structure of lysosomal targeting photosensitizer PC4,photodynamic therapy and imaging process[27]

圖10 溶酶體靶向光敏劑SCCs的結(jié)構(gòu)[28]Fig.10 Structure of lysosomal targeting photosensitizer SCCs[28]

Zhou等[32]報道了一種基于氟硼二吡咯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向光敏劑（boron dipyrromethene，BODIPY）（圖 11）。在中間氫原子處引入2個鹵素原子，通過重原子效應(yīng)BODIPY可以產(chǎn)生單線態(tài)氧。在BODIPY核心的部分引入格列本脲能使光敏劑特異性靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，激光照射下能明顯引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡。

圖11 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向光敏劑BODIPY的結(jié)構(gòu)和光動力治療過程的示意圖[32]Fig.11 Schematic diagram of the structure and photodynamic therapy process of endoplasmic reticulum targeted photosensitizer BODIPY[32]

Zhao等[33]將ER靶向部分甲基磺酰胺、小分子共軛分子靶向藥物厄洛替尼（erlotinib，EB）以及硅酞菁[silicon(IV)phthalocyanine dichloride，Pc]共價連接，合成目標(biāo)化合物EB-ER-Pc（圖12）。該化合物可以選擇性地在表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)進(jìn)行光動力治療。體外試驗證明，EB-ER-Pc具有優(yōu)良的腫瘤靶向特異性以及出色的光動力抗癌活性。

圖12 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向光敏劑EB-ER-Pc的結(jié)構(gòu)和光動力治療過程的示意圖[33]Fig.12 Schematic diagram of the structure and photodynamic therapy process of endoplasmic reticulum targeted photosensitizer EB-ER-Pc[33]

Deng等[34]開發(fā)了還原敏感性聚合物聚乙二醇-ss-1,2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基-（聚乙二醇）-2000]納米粒子。該納米離子負(fù)載了可以在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中累積的光敏劑，形成Ds-sP/TCPPTER NPs，在激光照射下原位產(chǎn)生ROS，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活免疫細(xì)胞并放大免疫原性死亡（immunogenic cancer cell death，ICD），同時進(jìn)行光動力 -免疫治療（圖 13）。

圖13 Ds-sP/TCPP-TER可以在ER中積累并在NIR激光照射下產(chǎn)生ROS，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激放大免疫原性死亡的示意圖[34]Fig.13 Ds-sP/TCPP-TER can accumulate in the ER and generate ROS under NIR laser irradiation,resulting in ER stress that amplifies ICD[34]

5 總結(jié)與展望

將光敏劑直接運(yùn)送到細(xì)胞器是一種具有前景的腫瘤光動力治療策略，可最大限度地發(fā)揮以腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞器為靶點(diǎn)的抗癌光動力治療的療效。基于納米載體細(xì)胞器靶向的光敏劑由于具有相對游離光敏劑更高的抗癌效果、更長的血液循環(huán)時間和在指定部位釋藥等優(yōu)點(diǎn)，已受到研究人員廣泛關(guān)注。通過在細(xì)胞層面的MTT和細(xì)胞增殖試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）試驗以及組織層面的蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，H&E）染色證明這些納米載體細(xì)胞器靶向光敏劑具有良好的生物安全性。目前大多數(shù)細(xì)胞器靶向光敏劑都是利用納米載體進(jìn)行遞送的，一些研究還構(gòu)建了診療一體的多功能納米平臺，有利于腫瘤的精準(zhǔn)個性化治療。納米載體的出現(xiàn)為理想給藥系統(tǒng)帶來了新的希望。然而，從基礎(chǔ)研究到臨床轉(zhuǎn)化的過程中，細(xì)胞器靶向納米載體的研究仍面臨以下問題和挑戰(zhàn)：1）開發(fā)更安全、生物相容性更好、可被機(jī)體代謝排泄的細(xì)胞器靶向納米光敏劑載體是今后光敏劑載體研究的重要方向，也是腫瘤細(xì)胞器靶向光動力治療能夠進(jìn)入臨床應(yīng)用的前提；2）構(gòu)建模塊化的智能型納米載體，能夠在特定條件刺激下釋放藥物，從而減少藥物進(jìn)入細(xì)胞器之前的泄漏，同時提升藥物在細(xì)胞器內(nèi)釋放的效率；3）在載體表面修飾各種靶向基團(tuán)是目前實現(xiàn)納米載體細(xì)胞器靶向功能的重要策略，但還需進(jìn)一步研究攜帶靶向基團(tuán)的納米載體與細(xì)胞器之間的相互作用機(jī)制，這有利于提升納米載體的細(xì)胞器靶向的效率以及光動力治療的效果；4）有些細(xì)胞器靶向納米載體具有很好的細(xì)胞器靶向性，但藥物在細(xì)胞器中的釋放不夠高效，因此需要建立并完善納米載體細(xì)胞器靶向效率及藥物釋放效率的評價機(jī)制。綜上所述，發(fā)展和優(yōu)化細(xì)胞器靶向納米光敏劑遞送系統(tǒng)以提高腫瘤光動力治療效果仍是今后納米光敏劑載體研究的重要方向。